溶菌酶协同高压CO2对酸土脂环酸杆菌芽孢的致死效果

周先汉，吴克平,*，曾庆梅，邹旭鹏，林秀峰

溶菌酶协同高压CO2对酸土脂环酸杆菌芽孢的致死效果

周先汉1，吴克平1,*，曾庆梅2，邹旭鹏1，林秀峰1

(1.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009；
2.合肥工业大学 农产品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009)

以芽孢致死率为评价指标，通过单因素和正交试验考察溶菌酶添加量、压力、温度和时间在高压CO2处理过程中对酸土脂环酸杆菌芽孢致死效果的影响，并优化杀菌条件。结果显示:溶菌酶添加量、压力和温度对芽孢致死效果的影响均显著(P＜0.05)，在溶菌酶添加量0.10g/kg、压力25MPa、温度55℃、时间60min的优化条件下芽孢致死率可达到5.47个数量级。另对此条件下处理后的样品进行高效液相色谱(HPLC)和扫描电子显微镜(SEM)检测，结果显示:芽孢核心物质2,6-吡啶二羧酸(DPA)发生大量泄露，且部分芽孢完全破裂，溶菌酶对高压CO2杀灭芽孢的协同效果显著(P＜0.05)。

高压CO2；溶菌酶；酸土脂环酸杆菌；芽孢致死率；2,6-吡啶二羧酸(DPA)；扫描电子显微镜镜(SEM)

酸土脂环酸杆菌是导致苹果汁、橘汁等热敏性果汁腐败的主要菌种[1-2]。该菌是一类产芽孢的嗜酸耐热菌，其孢子有很强的抗逆性，能经受95℃、2min的灭菌处理存活下来，并可在pH＜4的果汁中萌发生长而导致其腐败，热处理须在121℃条件下至少15min才能将其彻底杀灭[3]，这势必会对果汁的品质和营养造成极大破坏。

高压CO2技术(high pressure carbon dioxide，HPCD)是一种新型的冷杀菌技术，杀菌条件温和、低成本、无毒无残留，在热敏性果汁杀菌领域有着巨大前景[4]。目前，高压CO2杀菌方法在压力低于50MPa，温度低于60℃时能杀灭大约5～12个对数的营养细胞[5]，而对于细菌芽孢，单纯采用高压CO2在温和条件下难以达到理想的杀菌效果[6-7]。因此，为了减少芽孢对果汁的不利影响，实现在温和条件下有效杀灭芽孢，有必要采取有效措施来协同高压CO2杀菌。根据GB2760—2011《食品添加剂使用标准》，溶菌酶是一种天然抗菌免疫蛋白，具有无毒、易分解、无残留等优点，可用于食品的防腐保鲜，而且其化学性质稳定，在酸性条件下热稳定性强，能适应果汁的酸性环境[8]。曾庆孝等[9]对溶菌酶协同高静压杀灭嗜热脂肪杆菌芽孢的研究表明，溶菌酶有助于提高芽孢对压力的敏感性。目前有关溶菌酶协同高压CO2灭菌效果的研究还未见报道。本研究将调查研究溶菌酶用于协同高压CO2对芽孢的致死效果，并通过电镜观察和芽孢内容物的检测，初步推测芽孢的致死过程，旨在为高压CO2杀菌技术的进一步研究及其应用提供可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris 10374)、CICC403#液体培养基 中国工业微生物菌种保藏中心。

Na2HPO4、柠檬酸 无锡展望化工试剂有限公司；溶菌酶(20000U/mg) 上海源聚生物科技公司；CO2气体(纯度99.99%) 合肥恒隆气体制造有限公司；2,6-吡啶二羧酸(色谱纯) 上海晶纯试剂有限公司。

CICC403#液体培养基配方(pH4.0，固体培养基为在液体培养基中添加琼脂15g):CaCl2·2H2O 0.25g、MgSO4·7H2O 0.5g、(NH4)2SO40.2g、KH2PO43.0g、葡萄糖 5.0g、酵母膏2.0g、蒸馏水1L。所用培养基试剂均为分析纯；缓冲溶液(pH3.74)包括:0.1mol/L Na2HPO4、0.2mol/L柠檬酸。

1.2 仪器与设备

HA121-50-01-C超临界CO2萃取装置 江苏南通华安超临界萃取有限公司；TDL-50B台式离心机 上海安亭科学器械厂；SWO-CJ-1F超净工作台 苏州净化设备有限公司；SYQ-DSX-Z898手提式蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；YY0027-90电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；ACQUITY UPLC-LCT Premier XE液相色谱仪美国Waters公司；JSM-6490LV 扫描电子显微镜 日本电子公司。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液的制备[10]

用接种环将酸土脂环酸杆菌从斜面接种至液体培养基中，置于45℃摇床中活化培养24h。取适量活化菌液至固体培养基上，于45℃恒温培养箱中培养3d，置室温中培养4～5d，镜检芽孢数达到90%～95%时，在无菌条件下用无菌蒸馏水洗脱菌苔；4℃、5000r/min离心15min，弃上清液，用无菌蒸馏水清洗离心2次后，沉淀倒入无菌蒸馏水，(85±1)℃水浴30min杀死营养体，制成109～1010CFU/mL菌悬液，置于4℃冰箱中保存备用。

1.3.2 活菌数的检验

采用平板菌落计数法。将实验处理前后菌液稀释至一定浓度后，涂布于CTCC403#固体培养基上，45℃培养48h后计数，计数方法参照GB4789.21—2003《食品卫生微生物学检验 冷冻饮品、饮料检验》。

1.3.3 溶菌酶协同高压CO2处理

以10mL芽孢菌悬液加入到190mL无菌缓冲溶液中配成的200mL菌液作为处理基质。重复3次，取平均值。

单因素试验:分别考察以下4个因素对芽孢致死率的影响。

1)溶菌酶添加量:分别添加0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10g/kg溶菌酶后，立即将菌液倒入高压CO2萃取釜，在30MPa、50℃条件下处理60min。

2)处理压力:将溶菌酶(前一组优化得到的最佳添加量)加入菌液中，保持温度为50℃，分别在10、15、20、25、30、35MPa处理60min。

3)处理温度:固定其他条件(取前两组优化得到的溶菌酶添加量和处理压力)，分别在25、35、40、50、60、70℃条件下处理60min。

4)处理时间:固定其他条件(取前三组优化得到的溶菌酶添加量、处理压力和温度)，分别处理20、30、40、50、60、90min。

正交试验:依据单因素试验结果，选取L9(34)正交试验表，进一步优化杀菌条件。

1.3.4 芽孢致死率的测定

将处理后的菌液立即进行梯度稀释后涂布，45℃培养48h后计数，并按下式计算芽孢致死率。

1.3.52 ,6-吡啶二羧酸(DPA)的检测

取高压CO2处理后的菌液40mL，4℃、10000r/min离心10min，取上清液抽滤后进行真空浓缩，然后用0.22μm微孔滤膜过滤后，进行HPLC分析，色谱条件:色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)；流动相:体积比5:95的乙腈-水(10mmol/L乙酸铵＋0.1%甲酸)溶液；流速:0.3mL/min；进样量:标准品0.5μL，样液1μL；柱温:40℃；样品室温度: 10℃；进样周期:5min。

1.3.6 芽孢的电子显微镜制样方法[11]

将盖玻片裁成4块，洗净灭菌，样品面做好标记。将1%Formvar氯仿溶液滴在作好标记的玻片上，30s后吸干多余的液体，置于60℃烘箱30min后使用。将一定浓度菌悬液滴在制备好的载玻片上，静置1 0～15min，多余液体用滤纸吸干。待菌液刚蒸发完毕，加入0.1%戊二醛预固定1h，再用0.5%戊二醛置换固定2h。固定好的样品用0.1mol/L磷酸缓冲液清洗3次，每次5～10min。将样品依次置于30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇中脱水置换，每级置换时间为10～15min。将上述制备的样品在超低温冰箱中冷冻结晶后，于冷冻干燥机中－20℃干燥约20h，即可在电子显微镜下观察。

1.4 数据处理

利用Excel 2003软件处理实验数据。

2 结果与分析

2.1 不同溶菌酶添加量对杀菌效果的影响

图1 溶菌酶添加量对芽孢致死率的影响Fig.1 Effect of lysozyme dose on the death rate of Alicyclobacillus acidoterrestris spores

由图1可知，在30MPa、50℃条件下处理60min，随着溶菌酶添加量的增加，芽孢致死率显著升高(P＜0.05)，添加量在0.06～0.10g/kg之间时，与不添加溶菌酶时相比，其芽孢致死率至少提高了2个对数级，协同效果显著，添加量为0.10g/kg时达到最大；添加量在0.06～0.08g/kg时，差异显著(P＜0.05)，而在0.08～0.10g/kg时，差异不显著(P＞0.05)。故选择溶菌酶添加量在0.08g/kg左右为宜。

图2 处理压力对芽孢致死率的影响Fig.2 Effect of pressure on the death rate of Alicyclobacillus acidoterrestris spores

2.2 不同压力对杀菌效果的影响由图2可知，在溶菌酶添加量0.08g/kg，温度50℃处理60min的条件下，压力在10～25MPa之间对杀菌效果影响显著(P＜0.05)，随着压力的逐渐增大，芽孢致死率逐渐升高，压力升至25MPa时达到最大，这可能与压力致CO2渗透性提高和物理性伤害增强有关。但随着压力的继续升高，杀菌效果未见增强，可能是压力过高，导致了芽孢的部分聚集，抗压性相对增强，从而削弱了杀菌效果[12]。故选择处理压力在25MPa左右为宜。

2.3 不同温度对杀菌效果的影响

图3 处理温度对芽孢致死率的影响Fig.3 Effect of temperature on the death rate of Alicyclobacillus acidoterrestris spores

由图3可知，在溶菌酶添加量0.08g/kg、压力25MPa处理60min的条件下，随着处理温度的升高，芽孢致死率呈先增后减趋势，温度在25～50℃之间时芽孢致死率显著升高(P＜0.05)，温度为50℃时致死率达到最大。这一变化可能与溶菌酶的活性有较大关系，据报道溶菌酶作用的最适温度为45～50℃[13]；温度较低时，酶活性较弱，随着温度逐渐升高，酶活性逐渐提高，协同杀菌效果也随之增强，而温度达到60℃以后，酶可能部分失活，使杀菌效果有所减弱。故选择处理温度在50℃左右为宜。

2.4 不同时间对杀菌效果的影响

由图4可知，在溶菌酶添加量0.08g/kg、压力25MPa、温度50℃的条件下，随着处理时间的延长，芽孢致死率逐渐升高(P＜0.05)，在50min以后趋势逐渐平缓，处理时间90min与60min时相比，致死率仅提高约0.1个对数，可能是由于芽孢激活的是可逆的，处理时间的延长可能使已被激活的芽孢重新变成休眠状态[14]，而且溶菌酶的活性随着时间的延长也会逐渐降低，这些因素都可能影响杀菌效果。故选择处理时间在50min左右为宜。

图4 处理时间对芽孢致死率的影响Fig.4 Effect of treatment time on the death rate of Alicyclobacillus acidoterrestris spores

2.5 正交试验设计和结果分析

在单因素试验基础上，对芽孢致死率影响均显著(P＜0.05)的溶菌酶添加量、高压CO2处理压力、处理温度、处理时间4因素进行L9(34)正交试验，因素水平和结果见表1、2。

表1 正交试验设计及结果Table 1 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

由表1可知，影响芽孢致死率的因素主次顺序为A＞D＞B＞C，获得高芽孢致死率的因素水平组合为A3B3C3D2，此组合与正交表中芽孢致死率最高的7号试验组合A3B1C3D2同时进行验证实验，验证结果显示，A3B3C3D2组合的芽孢致死率为5.47，略高于7号试验组合A3B1C3D2的结果，故确定A3B3C3D2为最佳杀菌方案。

表2 正交试验方差分析表Table 2 Analysis of variance for the experimet results of orthogonal ayyay design

表2方差分析的结果显示，溶菌酶添加量、处理温度、处理压力均是影响芽孢致死率为极显著因素，而处理时间为显著性因素。综上所述，溶菌酶协同高压CO2杀灭芽孢的最佳条件为溶菌酶0.10g/kg、处理压力25MPa、处理温度55℃、处理时间60min。

2.6 DPA检测结果对比

图5 DPA标准品(A)、高压CO2单独处理后的菌液(B)以及溶菌酶协同高压CO2处理后的菌液(C)的高效液相色谱图Fig.5 HPLC profiles of DPA standard and Alicyclobacillus acidoterrestris spores treated with high pressure carbon dioxide alone or combined with lysozyme

DPA是细菌芽孢中特有的物质，存在于芽孢的核心部位，约占芽孢干质量的10%，它的一个重要功能是降低芽孢核心区的水分，通过保护芽孢核内的蛋白质、DNA来提高芽孢的抗性[15]，DPA的泄露量可反映芽孢的受损情况。实验对最优杀菌方案(图5C)下添加和未添加(图5B)溶菌酶的高压CO2处理液中的DPA泄露情况进行了HPLC分析，结果如图5所示。添加和未添加溶菌酶的高压CO2处理液中都检测到了DPA(保留时间分别为0.56min和0.59min，基本一致)，与未添加溶菌酶的处理液相比，添加了溶菌酶的处理液中DPA含量显著增加。高瑀珑等[16]研究认为，芽孢通透性屏障受损，物理结构被破坏，从而引起了芽孢DPA的泄漏，因此，以上结果说明在溶菌酶协同高压CO2作用下对芽孢通透性破坏程度较大，也可能发生了彻底的破裂，才会导致芽孢最核心的物质DPA发生较多渗漏。

2.7 扫描电子显微镜图对比

在优化的最佳杀菌条件下，分别对添加和未添加溶菌酶的高压CO2处理菌液进行电子显微镜制样及观察，结果如图6所示。

图6 未处理(A)、高压CO2单独处理后的菌液(B) 以及溶菌酶协同高压CO2处理后的菌液(C)的芽孢扫描电子显微镜图Fig.6 SEM images of Alicyclobacillus acidoterrestris spores before and after treatment with high pressure carbon dioxide alone or combined with lysozyme

由图6A可知，未经处理的酸土脂环酸杆菌的芽孢形态结构完整，为短杆的椭球形；由图6B可知，单独高压CO2处理后的芽孢大部分表面形态较完整，有少数发生凹陷、破裂、细胞内容物渗漏，推测主要是压力作用和CO2高渗透性产生的萃取作用导致了芽孢壁通透性的改变，芽孢内容物发生渗漏，生理代谢失衡，从而造成了芽孢的死亡；但同时发现处理后芽孢大部分产生聚集，削弱了压力和CO2的作用，这可能是导致芽孢致死率低的原因之一。而由图6C可明显看到，经过溶菌酶协同处理的芽孢在形态和结构上的发生了较大变化，可观察到一些细胞完全破裂，胞内物质渗漏和一些细胞壁空壳。可以推断溶菌酶对芽孢壁成分产生了某种分解作用(芽孢皮层和芽孢壁主要由肽聚糖组成，溶菌酶对肽聚糖分子具有破坏作用[17])，使得在压力作用下，CO2更容易渗透到芽孢内部，在卸压过程中CO2迅速扩散，使芽孢瞬间胀裂，崩溃。这一结果也进一步验证了图5C中DPA泄漏量较大的原因。

3 结 论

采用溶菌酶协同高压CO2处理优化的最佳杀菌条件为溶菌酶0.10g/kg、处理压力25MPa、处理温度55℃、处理时间60min，能使芽孢致死率达到5.47个数量级，与高压CO2单独处理(芽孢致死率为3.00个数量级左右)相比，提高了大约2.47个数量级。另外，由处理后样品的高效液相色谱和扫描电镜检测结果判定，溶菌酶对高压CO2杀菌的协同效果显著，两者共同作用导致了芽孢很大程度地受损和核心物质DPA的大量泄漏，从而造成芽孢大量死亡。

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Effects of Various Treatment Conditions on Efficacy of High Pressure Carbon Dioxide in Coordination with Lysozyme for Inactivating Alicyclobacillus acidoterrestris Spores

ZHOU Xian-han1，WU Ke-ping1,*，ZENG Qing-mei2，ZOU Xu-peng1，LIN Xiu-feng1
(1.College of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China；(2.Engineering Research Center of Bio-process, Ministry of Education, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

One-factor-at-a-time and orthogonal array design methods were used to optimize four treatment conditions including lysozyme dose, pressure, temperature and treatment time that influence the bactericidal activity (evaluated by death rate of spores) of lysozyme in coordination with high pressure carbon dioxide against Alicyclobacillus acidoterrestris spores. The results showed that lysozyme dose, pressure and temperature had a significant effect on the inactivation of Alicyclobacillus acidoterrestris spores (P＜ 0.05). The death rate of Alicyclobacillus acidoterrestris spores reached 5.47 orders of magnitude under the optimized conditions: lysozyme dose 0.10 g/kg, pressure 25 MPa, temperature 55 ℃ and treatment time 60 min. The HPLC analysis and observation under scanning electron microscopy (SEM) of Alicyclobacillus acidoterrestris spores treated under these conditions indicated large amounts of 2,6-pyridine dicarboxylic acid (DPA) leakage and complete rupture of partial spores. In conclusion, lysozyme has a significantly synergistic effect on the inactivation of Alicyclobacillus acidoterrestris spores by high pressure carbon dioxide (P＜ 0.05).

high pressure carbon dioxide；lysozyme；Alicyclobacillus acidoterrestris；death rate of spores；2,6-pyridine dicarboxylic acid (DPA)；scanning electron microscopy (SEM)

TS201.3

A

1002-6630(2012)15-0001-05

2011-07-07

国家自然科学基金项目(30871739；30571304)；国家“863”计划项目(2011AA100801)；

安徽省教育厅重点科研项目(KJ2007A099)

周先汉(1959—)，男，副教授，学士，研究方向为农产品深加工、食品安全。E-mail:zhxhan@163.com

*通信作者:吴克平(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为食品质量与安全。E-mail:crystal_1024@126.com