鱼露中生物胺降解菌的筛选及其特性

杨利昆，付湘晋,*，胡叶碧，周其中，李 滨

(1.中南林业科技大学 粮油深加工与品质控制湖南省重点实验室，湖南 长沙 410004；2.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004)

鱼露中生物胺降解菌的筛选及其特性

杨利昆1,2，付湘晋1,2,*，胡叶碧1,2，周其中2，李 滨1,2

(1.中南林业科技大学 粮油深加工与品质控制湖南省重点实验室，湖南 长沙 410004；2.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004)

从天然发酵鱼露中筛选具有生物胺降解活性的微生物，并研究发酵时间和发酵温度对其降解生物胺的影响。以天然发酵3个月的鱼露为分离材料，对鱼露中的生物胺降解菌进行分离纯化，获得10株具有生物胺降解活性的微生物。分离到的10株菌株在30℃发酵72h组胺降解率在17.3%～62.2%，酪胺降解率在12.4%～57.3%。其中M8菌株生物胺降解活性最高，经26S rDNA测序及在线序列比对，M8菌株鉴定为奥默柯达酵母。奥默柯达酵母M8在30℃条件下降解生物胺活性最强；其降解生物胺的时间变化规律为发酵第1天生物胺含量降低，第2天和第3天生物胺含量升高，第4天开始生物胺含量持续降低，30℃发酵9d后，组胺和酪胺降解率分别为69.6%和79.2%。奥默柯达酵母M8在25%食盐条件下生物胺降解效果最好，组胺和酪胺的降解率分别为64.4%和72.4%。

鱼露；生物胺；奥默柯达酵母

鱼露，又称鱼酱油，是一种风味独特的水产调味品，其味咸、极鲜美、营养丰富，含有所有的必需氨基酸和牛磺酸、钙、碘等多种矿物质和维生素，还含有大量生物活性肽[1]。近年来，鱼露工业发展迅速，目前国内产量每年约10万t以上[2]。

鱼露加工最主要的问题之一是生物胺含量较高[3]。生物胺是一系列含氮低分子有机碱，可分为单胺和多胺两类，包括酪胺、组胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺、精胺和亚精胺等多种物质。生物胺多存在于蛋白质含量高的食品中，如发酵香肠、鱼露、咸肉、咸鱼、干酪等[4]。生物胺在人体积累到较高数量时，会产生毒害，如：外部血管膨胀，导致高血压和头痛，以及肠部痉挛、腹泻和呕吐等。生物胺是造成食品中毒的重要因素之一，引起鱼类食品中毒的主要是组胺，引起干酪和发酵香肠中毒主要是组胺和酪胺。而且尸胺和腐胺还可以与亚硝酸盐反应生成致癌物质亚硝胺[5]。所以，生物胺是影响肉制品特别是发酵肉制品食用安全性的重要因素。

目前，鱼露中生物胺的研究主要集中在生物胺含量的检测[6]，鱼露发酵过程中生物胺含量变化规律[7]，产品加工条件对产品生物胺含量的影响等方面[8]。食品中生物胺主要是由微生物氨基酸脱羧酶催化氨基酸脱羧生成，食品加工条件控制不当和外源性微生物污染是引起生物胺在食品中的积累而达到或超过安全限值的主要原因。如鲜鱼制品、鱼露制品中的生物胺就是由于外源微生物污染所致[9-10]。

决定生物胺含量的另外一个重要因素是微生物胺氧化酶。胺氧化酶可以降解生物胺，避免生物胺的累积[11]。一般认为，在肉制品发酵初期，肉中游离氨基酸在细菌氨基酸脱羧酶的作用下，分解成生物胺。而随着发酵的进行，盐分逐渐渗入肉体，并分布均匀，逐渐升高的盐浓度和肉制品自身pH值的变化，抑制了生物胺产生菌的生长，而产胺分解酶的细菌却增加，从而使得生物胺含量降低。随着产胺分解酶的细菌的生长，两种细菌达到了一种平衡，胺含量趋于稳定。如发酵鱼露中组胺的变化趋势表明，在鱼露前期发酵过程中，组胺含量起初会有所升高，而后下降直至稳定[9]。有关食品中胺氧化酶及其产生菌的研究还很少，仅仅是对微生物进行初步的分离鉴定。如Dapkevicius等[11]从鱼露中分离到77株奥默柯达酵母菌，其中48株有胺氧化酶活力，特别是其中2株能消除鱼浆中50%以上的组胺。Fadda等[12]从发酵香肠中分离到的干酪乳杆菌CRL705能降解98%的酪胺。Leuschner等[13]发现，64株奥默柯达酵母菌中，27株有较低的胺氧化酶活力；32株亚麻短杆菌(Brevibacterium linens)中，21株有胺氧化酶活力；20株肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)中未发现有胺氧化酶活力；9株白地霉(Geotrichum candidum)中有1株显示轻微降解酪胺的活力；44株微球菌属(Micrococcus sp.)中，17株有胺氧化酶活力。但生物胺降解菌降解生物胺的特性还未见研究报道。

本实验从自然发酵鱼露中筛选分离具有生物胺降解活性的微生物，并研究培养温度、食盐质量分数对其降解生物胺的影响，使其能更好的在鱼露中运用，提高鱼露的食用安全性。同时，对其他生物胺含量高的食品(鱼露、发酵香肠、咸肉、咸鱼、酸奶、泡菜及葡萄酒等)的加工也有较高的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

自制发酵3个月的鱼露(食盐质量分数40%，料液比1:1，室温条件下发酵)。

甲醇、组胺、酪胺 美国Sigma公司；苯甲酰氯国药集团化学试剂有限公司；所有试剂均为分析纯。

LC24A高效液相色谱仪 日本岛津公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种分离及鉴定

分离培养基(MRS)：胰蛋白胨10.0g、磷酸氢二钾2.0g、葡萄糖20.0g、无水醋酸钠3.0g、牛肉浸膏10.0g、柠檬酸三铵2.0g、酵母浸膏5.0g、七水硫酸镁0.2g、食盐10.0g、吐温-80 1.0mL、L-半胱氨酸0.5g、水1000mL，pH6.8，121℃灭菌15min。

将发酵3个月的鱼露以1%接种量接种于50mL改良MRS液体培养基中，30℃培养，发酵2d。采用倾注法获得微生物单菌落。挑单菌落液体培养，培养2d后接种0.5mL菌液于装有2.5mL液体MRS培养基的无菌离心管中，同时分别加入0.5mL质量浓度为1mg/mL的组胺和酪胺，发酵3 d，离心，收集上清液，测定生物胺含量，从而确定是否具有生物胺降解活性。固体MRS培养基保存具有生物胺降解活性的微生物用于后续研究。采用26S rDNA测序法对分离到的活性菌进行鉴定。

1.2.2 奥默柯达酵母菌降解生物胺的特性

以分离到的生物胺降解活性最强的奥默柯达酵母菌(M8)为菌种，用上述(MRS)液体培养基，分别在30、35、40℃培养11d，每天测定生物胺的含量变化。

1.2.3 食盐质量分数对降解鱼露中生物胺的影响

以天然自制鱼露(食盐质量分数35%)后作为液体培养基，通过加蒸馏水调整鱼露的食盐质量分数分别为1 5%、2 0%、2 5%，灭菌后，接种M8，接种量1%，在30℃条件下培养11d，每天测定生物胺的含量变化。

1.2.4 HPLC法测定生物胺

采用外标法对样品中的生物胺进行定量。

1.2.4.1 标准溶液的配制

准确称取标准品酪胺和组胺各100mg，用0.1mol/L盐酸定容至100mL，制成质量浓度为1000mg/L混合标准储备液，置于4℃冰箱保存。吸取0.2、0.5、1.0、1.5、2.5mL上述生物胺标准混合使用液(100mg/L)，分别置于10mL容量瓶中，用0.1mol/L HCl稀释至刻度，混匀，配成最终质量浓度分别为20.0、50.0、100.0、150.0、250.0 mg/L的标准溶液。

1.2.4.2 样品的前处理及衍生化

用移液抢移取3.0mL发酵液置于5.0mL的离心管中，在5000×g离心30min，吸取1.0mL上清液进行衍生化处理。衍生过程参考Hwang[14]、Qzogul[15]等的方法，并稍作修改。具体方法是：取1.0mL样品，加入1.0mL 2mol/L NaOH调整pH值至碱性，加入10μL苯甲酰氯水浴30℃衍生处理40min，中间涡旋振荡4次，每次30s。而后加入2.0mL饱和NaCl于60℃水浴5min终止衍生化，加3.0mL乙醚，旋涡振荡混合2min，静置分层，移取上层有机相1.0mL至干净试管，用氮气吹干后，加1.0mL甲醇溶解，微滤(0.45μm)后用于测定生物胺含量。

1.2.4.3 色谱条件

色谱条件参考孟甜[16]的基础上，对梯度洗脱程序和柱温等进行了适当的改进。Waters symmetry C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，采用等浓度洗脱，流动相甲醇-水(70:30，V/V)；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；进样量：20μL；柱温：30℃。

2 结果与分析

2.1 生物胺标准品和发酵样品的图谱

通过分别对组胺和酪胺衍生化图谱，组胺和酪胺未衍生化图谱以及生物胺标准溶液的衍生化图谱的对照，确定组胺和酪胺的出峰位置。同时采用等浓度洗脱，生物胺标准品衍生物图谱见图1A。组胺(5.957min)和酪胺(8.190min)分离出峰速度快，10min内所有的生物胺衍生物都被洗脱出来。从生物胺降解菌发酵前后典型图谱(图1B、C)可以看出，各生物胺衍生物峰形对称，且无杂质干扰，因此该流动相等浓度洗脱是可行的。

图1 经生物胺降解菌发酵前后的衍生物色谱图Fig.1 Chromatograms of biogenic amine standards in MRS medium before and after degradation/fermentation

2.2 HPLC法测定生物胺峰面积与生物胺含量的线性关系

从1.2.4.1节的标准溶液中分别吸取1.0mL混合标准溶液，采用上述方法衍生、测定，每个质量浓度重复测定5次。采用外标法，将两种生物胺峰面积(y)与相应质量浓度(χ)进行线性回归，绘制校准曲线，组胺：y＝10691χ-49392(R2＝0.9965)；酪胺：y＝15518χ＋4979.7(R2＝0.9964)，表明这2种生物胺标准品在20.0～250.0mg/L质量浓度范围内线性关系良好(R2＞0.995)，证明该方法对测定2种生物胺具有良好的可靠性。

2.3 鱼露中生物胺降解菌的筛选结果

通过对鱼露中奥默柯达酵母菌的分离和纯化，获得46株单一菌种，对其进行单一菌种发酵后，HPLC法测定生物胺降解量。结果分离到10株具有生物胺降解能力的单一菌种，分别编号为M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10，将10株具有生物胺降解活性的单一菌株分别接种到含有组胺(18.5mg/L)和酪胺(18.5mg/L)的MRS液体培养基中30℃培养4d，以无菌条件下组胺和酪胺含量均为18.5mg/L的MRS液体培养基作为空白组，然后测定生物胺的含量，结果见表1。

表1 鱼露中生物胺降解生物胺菌株筛选结果Table 1 Screening of strains with degradation activity for biogenic amines

由表1可知，组胺含量范围在7.0～15.3mg/L，酪胺含量范围在7.9～16.2mg/L。奥默柯达酵母菌对组胺的降解率在17.3%～62.2%之间。奥默柯达酵母菌对酪胺的降解率在12.4%～57.3%之间。其中M8菌株对组胺和酪胺的降解率均为最高，分别达到62.2%和57.3%。

2.4 生物胺降解菌的鉴定

对筛选到降解活性最高的M8菌株进行26S rDNA测序，经Blast在线比对，在线比对结果见表2。

表2 26S rDNA序列Blast比对Table 2 Blast analysis of 26S rDNA sequences

该菌的26S rDNA序列与奥默柯达酵母的26S rDNA序列同源性高达100%，所以初步鉴定该菌为奥默柯达酵母。

2.5 生物胺降解菌在不同温度和时间中降解生物胺情况分析

图2 温度对M8菌株降解组胺的影响Fig.2 Effect of temperature on the degradation of histamine by strain M8

图3 温度对M8菌株降解酪胺的影响Fig.3 Effect of temperature on the degradation of tyramine by strain M8

由图2、3可知，随着发酵时间的进行，1d时生物胺含量显著降低，升至3d之后生物胺含量持续降低。在30℃时生物胺的含量最低，其次是35℃，最高的为40℃，在30℃条件下组胺和酪胺的降解率分别达到69.6%和79.2%。但是温度对生物胺含量变化的影响没有显著性。根据生物胺随发酵时间的变化规律分析，可能在1d时M8菌株生长可能处于适应期，同时其生长可以利用生物胺；2～3d时随着液体培养基的pH值急剧下降，M8菌株处于对数期，为适应其生长条件的改变，可能会产生生物胺(碱性)以稳定培养液的pH值，所以生物胺含量有所升高；在第4天和第8天M8菌株处于稳定期，菌体数量较大，生物胺降解酶活力较高，生物胺含量迅速降低。第8天开始，M8菌株处于衰退期，对生物胺含量的降解作用变弱直至稳定。

2.6 M8菌株在不同质量分数食盐鱼露中对生物胺降解的情况分析

图4 食盐质量分数对M8菌株降解组胺的影响Fig.4 Effect of salt concentration on the degradation of histamine by strain M8

图5 食盐质量分数对M8菌株降解酪胺的影响Fig.5 Effect of salt concentration on the degradation of tyramine by strain M8

由图4、5可知，随着发酵时间的进行，生物胺含量变化规律为：生物胺含量先降低，然后升高直至稳定。在食盐质量分数25%条件下生物胺降解效果最好，其次是20%，15%的生物胺降解效果最差。由于M8菌株是从饱和食盐浓度的鱼露中分解得到，M8菌株可能是嗜盐奥默柯达酵母菌。在食盐质量分数25%的条件下适宜其生长，在其发酵过程中可能产生了可以氧化降解生物胺的酶或者酶体系，组胺和酪胺的降解率分别达到64.4%和72.4%。

3 结 论

以天然发酵3个月的鱼露作为菌种分离材料，研究单一菌株对生物胺降解的影响，筛选到10株具有生物胺降解活性的菌株，证明了鱼露中拥有降解生物胺的微生物。其中以M8菌株降解活性最高，对其进行测序，经过在线比对，初步鉴定M8菌株为奥默柯达酵母。

本实验重点研究了温度和食盐质量分数对M8菌株降解生物胺的影响：30℃条件下生物胺的含量最低，其次是35℃，含量最高的为40℃；在30℃条件下，组胺和酪胺的降解率分别达到69.6%和79.2%。25%食盐质量分数条件下生物胺的含量最低，其次是20%，含量最高的为15%；在食盐质量分数25%的条件下，组胺和酪胺的降解率分别达到64.4%和72.4%。

筛选到的奥默柯达酵母菌菌能有效降解培养液和鱼露中的组胺和酪胺，但筛选到的奥默柯达酵母对鱼露品质的影响还需要进一步研究。本研究对其他生物胺含量高的食品(干酪、发酵香肠、咸肉、咸鱼、酸奶、泡菜及葡萄酒等)的加工也有较高的参考价值。

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Screening of Strains with Degradation Activity for Biogenic Amines in Fish Sauce

YANG Li-kun1,2，FU Xiang-jin1,2,*，HU Ye-bi1,2，ZHOU Qi-zhong2，LI Bin1,2

(1. Hunan Provincial Key Laboratory of Deeply Processing and Quality Control of Cereals and Oils, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China；2. College of Food Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China)

In the present study, strains with degradation activity for biogenic amines were screened from naturally fermented fish sauce, and the effects of fermentation time and temperature on the content of biogenic amines were investigated. A total of 10 strains were obtained from natural fish sauce subjected to fermentation for 3 months. After 72 hours of fermentation at 30 ℃, the degradation rate of histamine was in the range of 17.3%-62.2%, and the degradation rate of tyramine was in the range of 12.4%-57.3%. The strain M8 with the highest activity was identified as Kodamaea ohmeri yeast through 26S rDNA sequence and online sequence alignment. Meanwhile, the strain revealed the strongest degradation activity for biogenic amines at 30 ℃. During fermentation, the content of biogenic amines revealed a decrease on the first day and an increase on the second day as well as the highest level on the third day, and then exhibited a decrease trend until the end of fermentation. After 9 days of fermentation at 30 ℃, the contents of histamine and tyramine were reduced to 30.4% and 20.8% of the initial levels, respectively. The strain M8Kodamaea ohmeri yeast could reveal the best degradation activity for biogenic amines in the presence of 25% salt. Under the optimal conditions, histamine and tyramine were reduced to 35.6% and 27.6%, respectively.

fish sauce；biogenic amines；Kodamaea ohmeri

Q939.97；S986.2

A

1002-6630(2012)11-0158-05

2011-05-10

湖南省自然科学基金项目(11JJ5023)

杨利昆(1986—)，男，硕士研究生，研究方向为农产品贮藏与加工。E-mail：yanglikun1986@163.com

*通信作者：付湘晋(1980—)，男，讲师，博士，研究方向为水产品加工。E-mail：yangtzfu@yahoo.com.cn