红景天苷生物合成的细胞与分子生物学研究进展

祝顺琴，刘万宏*，戴传云

(1.西南大学生命科学学院，重庆 400715；2.重庆科技学院化学化工学院，重庆 401331)

红景天苷生物合成的细胞与分子生物学研究进展

祝顺琴1，刘万宏2,*，戴传云2

(1.西南大学生命科学学院，重庆 400715；2.重庆科技学院化学化工学院，重庆 401331)

红景天苷因其抗氧化、抗疲劳、延缓衰老等生物学功能成为当今天然产物研究的热门方向。本文综述了红景天苷生物合成途径及途径中的相关酶与基因；利用红景天愈伤组织和细胞培养生产红景天苷的方法，通过遗传转化获得毛状根生产红景天苷等细胞与分子生物学的研究。最后提出细胞工程和基因工程是解决药源缺乏的理想途径之一。

红景天苷；生物合成；细胞工程；基因工程

红景天属植物在欧洲和亚洲的很多国家有很悠久的药用历史，是一种优秀的抗外界环境压力的适应原；红景天中含有多种活性物质，如苷类、黄酮类、香豆素类、生物碱等[1]。其中主要药用成分为红景天苷(salidroside)；实验表明红景天苷具有抗氧化、抗缺氧、抗疲劳、防辐射、肿瘤抑制等多种生物活性，因此作为原料药和食品添加剂的使用越来越广泛[2]；近年来野生资源数量锐减，主要由以下原因造成：1)绝大多数红景天种类生境破碎，加上过度放牧和无计划人为采挖，致使红景天野生数量呈下降趋势；2)花粉表面光滑，不利于授粉。小孢子败育降低了生育花粉的数量[3]；3)近交衰退严重[4]；4)人工引种栽培根腐病较为严重，且对环境需要较高[5]；随着对红景天药理作用的认识不断深入，如何扩大药源以满足日益增长的需求，是目前生物学研究的热点之一。

利用现代生物技术开展濒危物种中特殊功能化合物的生物合成机理探索是目前生命科学领域研究热点之一，其中细胞与分子生物学的发展在这个领域得到了充分的应用；本文对红景天苷生物合成及利用细胞培养技术生产红景天苷相关的细胞与分子生物学最新研究做一系统综述。

1 红景天苷生物合成途径

1.1 红景天苷前体酪氨酸的来源

植物体内莽草酸(shikimate)经莽草酸激酶(shikimate kinase，aroK)催化合成莽草酸-3-磷酸(shikimate 3-phosphate)；后者在5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate，aroA)催化下与磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)结合，脱去一个磷酸基团，形成5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(5-

enolpyruvylshikimate-3-phosphate，EPSP)；EPSP在分支酸合酶(chorismate synthase，aroC)的作用下，脱去磷酸基团合成分支酸(chorismate)；分支酸是莽草酸途径的重要枢纽物质，它以后的去向分为两个分支[6]：一个分支走向色氨酸(tryptophan)，另一个分支是在分支酸变位酶(chorismate mutas，aroQ)催化下先形成预苯酸(prephenate)，经芳香族氨基酸转氨酶(aromatic-aminoacid transaminase，tyrB)催化加氨合成阿罗酸(arogenicacid)，随后阿罗酸在阿罗酸脱氢酶(arogenate dehydrogenase，tyrC)的催化合成酪氨酸(tyrosine)进入红景天苷生物合成途径[7]。

1.2 红景天苷生物合成途径

图1 红景天苷生物合成途径Fig.1 Biosynthetic pathways of salidroside

红景天苷属于酪氨酸代谢产物，其生物合成途径己经基本阐明(图1)；来源于莽草酸途径的酪氨酸在红景天苷合成关键酶酪氨酸脱羧酶(tyrosine decarboxylase，TyDC)催化下合成酪胺(tyramine)，后者为异喹啉生物碱(isoquinoline alkaloid)生物合成重要前体；酪胺在单氨氧化酶(monoamine oxidase, MAOA)催化合成p-羟苯乙醛(4-hydroxyphenylacetaldehyde，4-HPAA)；随后4-HPAA在p-羟苯醇脱氢酶(p-hydroxybenzyl alcohol dehydrogenase，areB)还原合成红景天苷的苷元酪醇(tyrosol)，该反应依赖NADH的参与；红景天苷合成最后一步在关键酶尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，UGT)催化作用下以尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和酪醇为底物合成红景天苷。

2 红景天苷生物合成的关键酶与基因

近年来，由于自然生境的破坏和人为无计划采收红景天自然资源，导致红景天濒危；利用现代生物技术扩大药源是解决人类需求与自然供给矛盾的有效途径；由于红景天苷生物合成途径基本清楚，利用基因工程遗传改良合成途径成为可能，而首先需要解决的就是对途径中酶与基因的分离以及功能的鉴定；本文从红景天植物中分离与红景天苷合成2个关键酶与基因做一简单综述。

2.1 酪氨酸脱羧酶(tyrosine decarboxylase，TyDC)

TyDC依赖于吡哆醛-5-磷酸(pyridoxal-5-phosphate，PLP)，催化来源于莽草酸合成途径酪氨酸脱羧，产生CO2和酪氨。Bartley等[8]对柑橘属的不同物种的TyDC基因进行了较为系统的研究，发现TyDC基因对辛弗林(synephrine)的合成起到了一定的遗传决定作用；Lee等[9]采用来源玉米泛素启动子异位超表达TyDC基因，在转基因水稻中考察酪氨酸衍生物章鱼胺(octopamine)的含量发现，在转基因水稻的叶片中章鱼胺的含量较野生型水稻提高了4倍。Lehmann等[10]采用RACE技术获得拟南芥TyDC基因，考察多个外部刺激因子对基因表达的影响，发现伤害处理使得基因转录大大上调，干旱胁迫也使得基因转录有所上调，其他刺激因子如温度、黑暗差异不显著，揭示TyDC在植物抗逆性中具有功能；同时构建GFP-TyDC考察亚细胞定位，发现TyDC定位于细胞质中。Park等[11]利用胚乳特异启动子表达编码N-羟基肉桂酰转移酶(N-hydroxycinnamoyltransferase)和TyDC两个基因，发现在植物中含量很低的两个酪氨酸衍生物对羟基苯乙基阿魏酰胺(feruloyltyramine)和4-香豆酰酪胺(4-coumaroyltyramine)在转基因水稻种子中含量显著增加，说明TyDC在对酪氨酸衍生物的积累起到重要作用。

由于植物细胞壁上常结合有羟基肉桂酸酪氨酰胺等酚类物质，以抵御外界病原菌的侵染。增加细胞中酪氨的含量可能获得更多的酚类物质，增强作物的抗病能力。基于此，Landtag等[12]将来源于欧芹的TyDC基因通过农杆菌介导转入马铃薯，希望获得抗病的马铃薯。然而实验结果与预期并不一致，在转基因细胞的细胞壁中结合的酚类物质的形式和数量并没有发生变化，却发现细胞合成几个从未在马铃薯中合成的化合物，其中主要的就是红景天苷；Gyorgy等[13]从红景天中分离获得TyDC基因，包含963bp的开放读码框，编码320个氨基酸残基。通过实时定量PCR检测发现，TyDC在红景天中叶和根中均有表达，而根中表达量大大高于叶，这与红景天苷在植物中不同器官的含量相对应，并且高含量株TyDC的基因表达较低含量株要高，这表明TyDC与红景天苷的生物合成密切相关，具有组织特异性。

2.2 尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，UGT)

在次生代谢产物合成中，UGT表现出十分重要的功能。甜叶菊(Stevia rebaudiana)叶子中含有至少8个不同的甜菊糖苷化合物，这主要是不同的糖基转移酶在苷元不同位点催化糖基化反应而致。Richman等[14]对甜叶菊中UGT做了系统地功能基因组研究，从54个EST序列中获得12个UGT基因的全长，体外原核表达并对蛋白进行酶功能验证发现其中3个UGT可选择性的糖基化苷元甜叶醇(steviol)上的不同位点。花色苷也是植物中重要的次生代谢产物，主要影响花的颜色，吸引昆虫授粉。而花色苷的稳定性和在水中的溶解度均需要糖基化步骤的参与[15]。

红景天苷(酪醇-β-D-葡萄糖苷)是由葡糖糖与酪醇以苷键结合的小分子化合物，这类反应由糖基转运酶进行催化。糖基转运酶一个主要的功能就是将高能单糖残基转移至糖、蛋白质、脂类、核酸以及另外一些小分子等受体分子上完成糖基化。Ma Lanqing等[16]从高山红景天(Rhodiola sachalinensis A. Bor.)中克隆全长为1598bp糖基转移酶基因UGT73B6，Southern杂交分析表明基因在高山红景天基因组中存在1个拷贝，Northern杂交结果表明，基因在根、茎及愈伤组织中均表达而在叶片中不表达。用农杆菌介导将基因遗传转化至高山红景天中，在获得的转基因愈伤和植株中红景天苷的含量均明显高于对照，揭示UGT73B6基因在红景天苷生物合成中起到一个重要的作用。

3 利用细胞工程合成红景天苷的研究

诱导植物愈伤组织，通过细胞培养的方式生产有价值的次生代谢产物具有广大的应用前景，目前有不少成功的案例如紫草宁、小檗碱、紫杉醇等；然而阻碍利用细胞生产次生代谢产物大规模生产的主要瓶颈在于生物量的积累和次生代谢产物产量低下。因此，筛选适合商业化生产的高产细胞株是现代生物技术研究的热点之一。

3.1 红景天愈伤组织的诱导及再生

利用细胞工程大规模工业化生产红景天苷的前提之一就是红景天离体培养的成功，以获得大量愈伤组织和植物细胞。盛长忠等[17]采用正交试验的方法考察不同激素诱导四裂红景天(Rhodiola quadrifida)愈伤组织和细胞培养的影响，以MS为基本培养基，激素配比为2,4-D 1mg/L、NAA 2mg/L、6-BA 0.5mg/L、KT 0.1mg/L时诱导率为83.3%；而在最适细胞培养的激素配比为2,4-D 1mg/L、6-BA 0.1mg/L、KT 0.5mg/L，红景天愈伤组织在诱导期与培养期激素种类和浓度差异较大。Wu Shuangxiu等[18]对高山红景天细胞培养做了系统的研究，发现外植体来源于子叶、叶和茎均可在3～5d内诱导出愈伤组织，诱导率分别为95%、80%和75%，而来源于根的外植体很难获得愈伤组织；BA是诱导愈伤组织必要的激素，同时IBA、IAA和NAA有利于愈伤组织的形成以及细胞的生长。

建立愈伤组织再生体系对红景天的组织快速繁殖及转基因植株获得等研究提供了有利的理论与实践基础；Zych等[19]利用藻酸钙(calcium alginate)包埋狭叶红景天(Rhodiola kirilowii)的腋芽与正在分化的愈伤组织，在4℃保藏6周后，转移至无激素的MS培养基中，腋芽与愈伤能发育成植株；在红景天生根培养研究发现激素浓度为IBA 2mg/L、IAA 0.2mg/L的1/2 MS培养基获得高效的生根率，移栽至珍珠岩、泥炭、土壤质量比为1:1:2的基质中，成活率达70%，且植株生理形态与野生植株相似，这对红景天的栖息地回复、种植资源保藏、生物工程应用等方面提供了有价值的理论参考[20]。

3.2 悬浮培养合成红景天苷的研究

利用细胞培养技术来取代直接从植株提取次生代谢产物是对自然资源的保护，特别是对保护濒危植物具有重大的意义。然而，由于体外培养细胞的去分化作用，造成不能形成如同植物中高度的区室化，导致细胞合成次生代谢产物的能力有限。因此，培养筛选高产目标产物的紧凑愈伤组织聚集体(compact callus aggregates，CAA)是目前植物细胞工程研究的热点之一[21]；Xu Jianfeng等[22]以高山红景天茎段为外植体诱导获得直径为2～7mm、表面光滑、球形CAA-type愈伤组织，组织化学分析显示CAA结构有利于养分的运输；摇瓶悬浮培养测定CAA生长及红景天苷合成动力学显示细胞增殖指数增长期较短，在细胞周期中主要以稳定期存在，细胞增长与细胞合成红景天苷不偶联；细胞增长量为0.60g/(d·L)；CAA合成红景天苷含量为0.68%，较分散细胞产率高6倍。

3.3 前体与诱导子对红景天苷合成的影响

在植物细胞培养体系中适当的添加对细胞毒害较小的化学物质，特别是添加在生物合成途径中与目标产物距离更为接近的前体物质，对提高次生代谢产物的含量积累能起到有效的作用[23]；在悬浮细胞培养液中添加红景天苷化学结构类似物乙酰水杨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸及酪醇，发现5个化合物均影响细胞生长及红景天苷的合成，其中酪醇会显著推动红景天苷的合成，其含量较对照株高26倍[18]；Krajewska-Patan等[24]在培养液中添加3～5mmol/L p-酪醇，红景天苷积累显著增加到11.06mg/g，较对照提高了110倍；葡萄糖是细胞可直接利用的碳源，也是红景天苷生物合成中的重要原料， Gyorgy等[25]测定了不同浓度葡萄糖中红景天细胞合成糖苷类化合物的含量发现，葡萄糖的增加可以使得一些糖苷类化合物含量上升，其中肉桂醇苷最高上升了2倍，而红景天苷并没有增加，暗示红景天苷合成中的主要限制因素是其前体酪醇在细胞中的积累。利用黑曲霉、云芝和灵芝考察生物诱导子对红景天毛状根合成红景天苷的影响，发现诱导子对生物量的积累有很大促进，而且对红景天苷的合成从0.42%高到0.71%[26]；在利用细胞工程生产红景天苷工艺中，添加廉价易得的化学物质，在不减少生物量积累的同时，使得红景天苷含量达到大规模工业化生产的目标，这将是工业生产工艺研究的重点。

4 利用毛状根生产红景天苷的研究

利用毛状根培养技术生产药物、食用色素、香精香料等重要植物次生代谢物。在莨菪发根中同时过量表达东莨菪碱生物合成途径上的两个限速酶基因pmt和h6h，获得的转基因发根中东莨菪碱含量比对照组提高了9倍[27]；目前对转基因药用植物器官和组织的研究较多，已有青蒿、黄芪、丹参等10多种药用植物的发根诱导成功并建立培养系统，这些成功的事例都说明了利用基因工程对植物遗传转化来生产或提高次生代谢产物含量是切实可行。Zhou Xiaofu等[26]利用发根农杆菌A4菌株侵染高山红景天(R. sachalinensis)诱导获得毛状根，并对转化工程中侵染时间、菌体浓度、共培养时间等参数进行了优化；其中毛状根中红景天苷含量为0.42%。目前还没有将关键酶基因TyDC和UGT转入红景天毛状根的报道，由于这2个基因在红景天苷的生物合成中起到重要的调节作用，是一个值得研究的方向。

5 利用生物酶法合成红景天苷

红景天苷合成的最后一步即酪醇与葡萄糖脱水形成糖苷键，而p-酪醇和β-D-葡萄糖是廉价易得的化工原料，因此，采用生物酶法合成红景天苷的方法是可行的。Zhang Lei等[28]从黑曲霉MS-48中分离纯化一个大小为84.6kD的糖苷酶Salidrosidase，在p-酪醇质量浓度为1.5g/100mL、β-D-葡萄糖质量浓度为6g/100mL、温度45.8℃、pH值为5.0的条件下反应6h，红景天苷的产率为10%。这是首次报道利用微生物酶合成红景天苷的报道，为红景天苷半合成提供了新的方向。

6 展 望

人工培育高含量红景天苷的红景天植物栽培品种所需的生境要求高，劳动成本大，很难适应日益增长的需求；而且红景天根腐病的防治提高了种植成本，导致人工种植量很难满足市场需求[29]；红景天苷化学全合成虽然已经成功[30]，但是合成过程中参入化学试剂，很难应用到食品行业；相比之下，利用基因工程遗传改良红景天，开展红景天苷代谢工程研究，进而利用细胞工程生产红景天苷就具有很大优势；大量的细胞实验证实利用细胞工程手段生产红景天苷是可行的，目前需要解决的就是工艺参数的优化；而越来越多的分子生物学证据显示红景天苷生物合成中起到限制性的因素是酪氨的积累，这可能存在反馈抑制；借鉴前人的研究思路，如获得酪氨反馈不敏感红景天突变株，可能会大大增加红景天苷的含量[31]。因而利用基因工程结合细胞工程是将来生产红景天苷的理想途径，红景天苷生物合成分子生物学研究和细胞工程研究在这方面将起到决定作用，为最终实现红景天苷商业化生产奠定理论基础。

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Advances in Studies on Cellular and Molecular Biology of Salidroside Biosynthesis

ZHU Shun-qin1，LIU Wan-hong2,*，DAI Chuan-yun2
(1.College of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Chongqing University of Science and Technology, Chongqing 401331, China)

Research into salidroside as a naturally occurring compound is a hot topic nowadays due to its multiple bioactivities such as antioxidant, anti-fatigue, and anti-aging functions. This review covers the following aspects of the cellular and molecular biology of salidroside biosynthesis: (1) biosynthesis pathways and related enzymes and genes; (2) salidroside production by Rhodiola rosea callus and cell culture; (3) salidroside production from hair roots obtained by genetic transformation. Therefore, cell engineering and genetic engineering strategies can provide suitable strategies to solve the lack of drug resources.

salidroside；biosynthesis；cell engineering；genetic engineering

Q291

A

1002-6630(2012)03-0267-05

2011-01-14

重庆市科学技术委员会自然科学基金计划资助项目(2010BB5296)；重庆市教育委员会科技研究项目(KJ101401)；中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(XDJK2011C017)

祝顺琴(1981—)，女，讲师，硕士，研究方向为植物基因工程。E-mail：zhushunqin@163.com

*通信作者： 刘万宏(1979—)，男，讲师，硕士，研究方向为药用植物次生代谢工程。 E-mail：liuwanh@163.com