珠母贝糖胺聚糖PG-II诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的研究

吴红棉，金晓石，范秀萍，胡雪琼，钟 敏，雷晓凌

(广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088)

珠母贝糖胺聚糖PG-II诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡的研究

吴红棉，金晓石，范秀萍，胡雪琼，钟 敏，雷晓凌

(广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088)

目的：探讨珠母贝糖胺聚糖PG-II诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡，从而抑制其增殖。方法：MTT法检测珠母贝糖胺聚糖PG-II对人宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用。倒置显微镜、荧光显微镜观察HeLa细胞凋亡的形态学特征，琼脂糖凝胶电泳检测DNA断裂片段，流式细胞仪定量检测细胞凋亡的百分率及对其细胞周期的影响。结果：MTT法显示PG-II可抑制人宫颈癌 HeLa细胞的增殖。倒置显微镜和荧光显微镜形态学观察可见HeLa细胞凋亡的形态明显变化。琼脂糖凝胶电泳显示PG-II作用HeLa细胞24h，出现分子质量为200bp到2000bp不等的细胞凋亡的特征性DNA梯状条带。流式细胞术测试表明：PG-II可使HeLa细胞阻滞于G1期，剂量为100mg/L作用24h阻滞作用最明显，凋亡指数为 42.6%。结论：珠母贝糖胺聚糖PG-II可能通过诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡而抑制其增殖。

珠母贝糖胺聚糖；人宫颈癌HeLa细胞；细胞凋亡

马氏珠母贝(Pinctada martensii(Dunder)) 是我国南海珠母贝的主要贝种，在广东、广西部分地区养殖量极大。珠母贝全脏器俗称珍珠贝肉，价格低廉，除部分食用外，大部分作为饲饵料，造成该资源的很大浪费，极待开发利用。本课题组长期从事马氏珠母贝全脏器活性成分的研究，前期的工作已从马氏珠母贝全脏器中分离纯化得珠母贝糖胺聚糖PG-II，分析测得其总氨基己糖含量分别为59.2%，硫酸基含量为2.9%[1-2]；抗肿瘤实验表明其对HL-60细胞都有杀伤作用，与临床抗癌药(5-氟尿嘧啶)合用有增强抗癌药抑瘤率的作用[3-4]。本实验研究珠母贝糖胺聚糖PG-II对人宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响，探讨其抑制肿瘤细胞增殖的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马氏珠母贝(Pinctada martensii (Dunder))，购自雷州市流沙镇珍珠养殖场；珠母贝糖胺聚糖PG-II由本实验室提纯。

人宫颈癌 HeLa细胞 广东海洋大学海洋药物研究所；5-氟尿嘧啶(5-Fu) 市售针剂；琼脂糖凝胶 北京鼎国生物技术发展中心；DNA Ladder分子质量标准品美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

NAPCO5420-1 CO2培养箱 美国Precision Scientific 公司；EPPENDORF 5417R 型冷冻离心机 德国Eppendorf公司；DG5031酶联免疫检测仪 华东电子管厂；CH30RF 200倒置显微镜 日本Olympus 公司；EPICS XL 流式细胞仪 美国Coulter 公司；YLN-200DB凝胶影像分析系统 北京亚力恩机电技术中心；TE300荧光倒置显微镜日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 珠母贝糖胺聚糖的分离纯化方法

马氏珠母贝全脏器经双酶水解、醇沉得到珠母贝糖胺聚糖粗品(CPG)，经DEAE-52纤维素柱层析得PG-II。工艺流程：马氏珠母贝全脏器→匀浆→蛋白酶双酶水解→醇沉→洗涤→真空干燥→糖胺聚糖粗品(CPG)→DEAE-52纤维素柱层析→PG-II。

1.3.2MTT法

取细胞浓度为104个/mL对数生长期的HeLa细胞，体积180μL，加入不同质量浓度的药液20μL(加药终质量浓度为10、 25、50、100mg/L，阳性对照组加入临床药物5-Fu(120mg/L)，对照组加入同体积的RPMI-1640培养液，每组设4个平行孔，充分混匀后于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下，继续培养12、24h(终止培养前6h，每孔加5g/L MTT 20μL)。吸弃上清夜100μL后，每孔加DMSO100μL，振荡5min，波长570nm处测定吸光度，并计算抑制率和增敏效果[5]。

式中：EA+B为合并用药的抑制率；EA和EB分别为A药和B药单独用药的抑制率。

1.3.3 倒置显微镜观察法

将含有细胞的24孔培养板直接置于倒置显微镜下观察。比较经过诱导和未经过诱导的细胞形态、大小和有无凋亡小体的出现，记录结果。

1.3.4 荧光显微镜观察法

Hoechst33342标记法[5-6]。将预处理的盖玻片置于6孔板内，种入细胞培养过夜。加入PG-II (终质量浓度为100mg/L)、PG-II+5-Fu(终质量浓度：PG-II 100mg/L、5-Fu 120mg/L)，刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，用PBS摇床洗涤两遍，每次3min，吸尽液体。加入0.5mL Hoechst 33342染色液，染色15min。用PBS洗两遍，每次3min。滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，荧光显微镜检测，激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右。

1.3.5DNA片断化电泳

培养细胞用PBS清洗、离心，加入细胞裂解液裂解，高速离心，上清液用酚/氯仿/醇抽提3次，RNA酶消化，然后加到含溴化乙锭1%的琼脂糖凝胶的样品的孔中进行电泳，在紫外线灯下观察和摄影。

1.3.6 流式细胞仪分析[7]

取对数生长期HeLa细胞，加100mg/L 样品，另设空白对照组，于5% CO2孵箱中培养12、24h后加入质量分数0.25%的胰蛋白酶细胞消化，1500r/min离心10min后弃上清，用PBS和体积分数70%乙醇于ˉ20℃过夜固定，隔天用PBS漂洗后，用20mg/L碘化丙啶(PI)(含RNA酶)避光染色30min，流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡率。数据用Multicycle分析软件处理。

1.3.7 数据处理

实验数据以χˉ±s 表示，应用SPSS13.0 软件进行方差分析，P＜0.05 有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 珠母贝糖胺聚糖对HeLa细胞增殖的抑制作用

如表1所示，PG-II体外对HeLa细胞有显著抑制作用，其效果与时间和剂量相关，100mg/LPG-II作用HeLa细胞12、24h对细胞生长的抑制率分别为27.8% (P＜0.05)和40.0%(P＜0.01)。如表2所示，PG-II与5-Fu联合作用抑制率得到极显著提高(P＜0.001)。说明PG-Ⅱ可抑制HeLa细胞增殖，并可增敏抗肿瘤药物5-Fu的作用。

2.2 珠母贝糖胺聚糖诱导HeLa细胞凋亡的形态学变化

用倒置显微镜观察PG-II作用下HeLa细胞的形态学变化，如图1所示，对照组细胞形态呈长梭状，细胞均匀透亮，贴壁，呈扁平不规则多角形，中有圆形核，细胞紧密相连。加样品组24h作用后，细胞体积变小，出现皱缩、变圆、脱落现象，细胞间接触开始消失，细胞不透亮，轮廓模糊。

表1 PG-II对HeLa细胞的抑制作用(±s, n=3)Table 1 Inhibition effect of PG-II on HeLa cells (χˉ±s, n=3)

表1 PG-II对HeLa细胞的抑制作用(±s, n=3)Table 1 Inhibition effect of PG-II on HeLa cells (χˉ±s, n=3)

注：*.与对照组相比，有显著性差异(P＜0.05)；**.与对照组相比，有极显著差异(P＜0.01)。下同。

24h A570nm抑制率/%IC50/(mg/L)A570nm抑制率/%IC50/ (mg/L)对照组0.144±0.0080.140±0.008 5-Fu组1200.097±0.002**32.61840.089±0.004*36.3165 100.124±0.01113.90.127±0.004*9.3 PG-II组250.111±0.005*22.90.107±0.001*23.641.2 500.107±0.012**25.763.80.092±0.002**34.3 1000.104±0.003*27.80.084±0.013**40.0样品剂量/( mg/L)12h

表2 PG-II与5-Fu合用对HeLa细胞的抑制作用±s, n=3)Table 2 Inhibition effect of PG-II combined with 5-Fu on HeLa cells (χˉ±s, n=3)

表2 PG-II与5-Fu合用对HeLa细胞的抑制作用±s, n=3)Table 2 Inhibition effect of PG-II combined with 5-Fu on HeLa cells (χˉ±s, n=3)

注：*** .与对照组相比，有极显著差异(P＜0.001)；+. 0.85≤q≤1.15，增敏作用为单纯相加；+ +. 1.15≤q≤20为增强作用；+ + +. q＞20为显著增强作用；ˉ. 0.55≤q≤0.85为拮抗作用；ˉˉ.q＜0.55为明显拮抗作用。

24h A570nm抑制率/%q增敏效果A570nm抑制率/%q增敏效果对照组0.144±0.0080.140±0.008 5-Fu组1200.097±0.002**32.60.089±0.004*36.3 10+1200.090±0.010*37.50.89+0.107±0.007***23.60.56ˉ PG-II+5-Fu组25+1200.079±0.009*45.10.93+0.086±0.006***38.60.75ˉ 50+1200.073±0.004**49.30.99+0.061±0.009***56.40.97+ 100+1200.059±0.022**59.01.15++0.034±0.004***75.71.23++样品剂量/ (mg/L)12h

图1 倒置显微镜观察HeLa细胞形态学变化(×400)Fig.1 Morphological changes of apoptotic HeLa cells under inverted microscope(×400)

图2 荧光倒置显微镜观察PG-II诱导HeLa细胞12h后的形态学变化(×200)Fig.2 Morphological changes of HeLa cells after 12 h of PG-II induction under inverted fluorescence microscope(×200)

图3 荧光倒置显微镜观察PG-II诱导HeLa细胞24h后的形态学变化(×200)Fig.3 Morphological changes of HeLa cells after 24 h of PG-II induction under inverted fluorescence microscope(×200)

用荧光显微镜观察PG-Ⅱ作用HeLa细胞的形态学变化，如图2、3所示，对照组细胞均质透亮，贴壁，呈长梭状，细胞紧密相连。加样品组作用12h后，细胞体积缩小，出现皱缩、变圆，细胞膜附近荧光强度增大；作用24h后，细胞体积明显变小，出现黄绿色荧光边聚，细胞质和细胞核荧光渐弱，直至消失。

2.3 珠母贝糖胺聚糖诱导HeLa细胞凋亡的DNA片段变化

PG-II作用HeLa细胞后的DNA片断化分析结果如图4所示，6h时显示加样孔附近出现一段大分子质量的条带，相对分子质量为几万到几十万；12h可见典型的DNA梯状带；24h后DNA电泳呈涂片状，分子质量低于200bp的短片段大量出现。说明PG-II作用出现了细胞凋亡的特征性的梯形带，所产生的DNA梯形带随时间延长，条带越来越亮，显示出凋亡程度越来越大。

图4 珠母贝糖胺聚糖诱导HeLa细胞凋亡的DNA片段化分析Fig.4 Agarose gel electrophoresis of DNA fragments from HeLa cells after different periods of PG-II induction

2.4 珠母贝糖胺聚糖诱导HeLa细胞阻滞细胞周期的作用

表3 100mg/L PG-Ⅱ作用HeLa细胞后的细胞周期分布±s, n=3)Table 3 Cell cycle distribution of HeLa cells after induction with 100 mg/L PG-Ⅱ (±s, n=3)

表3 100mg/L PG-Ⅱ作用HeLa细胞后的细胞周期分布±s, n=3)Table 3 Cell cycle distribution of HeLa cells after induction with 100 mg/L PG-Ⅱ (±s, n=3)

组别 细胞周期分布/% Sub-G1G0/G1SG2/M对照组(12h)2.13±0.1359.4±0.730.5±0.310.0±0.9实验组(12h)31.4±2.3**43.2±2.3**46.4±0.7*10.4±1.2对照组(24h)5.44±0.1867.9±1.121.3±2.310.8±0.3实验组(24h)42.6±2.7**33.0±0.1**58.1±3.6*8.9±0.4

如表3所示，剂量为100mg/L的PG-Ⅱ作用HeLa细胞12h后出现凋亡峰，凋亡指数为31.4%，G0/G1期细胞百分比减少，S期细胞百分比增加，G2/M期细胞无大的变化；作用24h后出现凋亡峰，凋亡指数增加为42.6%，G0/G1期细胞百分比显著减少，S期细胞百分比增加，G2/M期细胞百分比有一定减少。结果表明：PG-Ⅱ可使HeLa细胞阻滞于G1期。

3 讨 论

大量文献表明，多糖类化合物可以通过诱导细胞凋亡而抑制肿瘤细胞的增殖[6,8-9]。本研究应用MTT法检测到珠母贝糖胺聚糖PG-II可以剂量和时间依赖关系抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖。

细胞凋亡是由内在的有规律的机制引起的，其特征是细胞首先变圆，随机与邻周细胞脱离，失去微绒毛，胞浆浓缩，核染色体密度增高呈半月形，并凝集在核膜周边，核仁裂解，进而细胞内陷，并芽突形成凋亡小体。用荧光探针染凋亡细胞DNA，即可在荧光显微镜下直接观察核形态变化[7，10]。本实验通过倒置显微镜和荧光显微镜观察，从形态学上证实珠母贝糖胺聚糖PG-II能够诱发HeLa细胞凋亡，出现凋亡的形态学特征。

细胞凋亡时，在内源性核酸内切酶的作用下，DNA在核小体间被切割成180～200bp整数倍的单或寡核苷酸片段，在电泳时表现为特征性的“梯形带”。本研究中通过琼脂糖凝胶电泳显示不同时间段DNA梯带，发现PG-II作用HeLa细胞12～24h时，出现分子质量为200bp到2000bp不等的细胞凋亡的特征性DNA梯形带，所产生的DNA梯形带随时间延长，条带越来越亮，显示出凋亡程度越来越大。此发现进一步证明了珠母贝糖胺聚糖PG-II能够诱发HeLa细胞凋亡。

通过流式细胞仪可分析细胞凋亡时DNA减少的细胞[11]。将DNA减少的细胞绘制在DNA含量直方图上，在正常G0/G1细胞群前会出现一DNA低染细胞群，称“亚G1细胞群，Sub-G1”，即凋亡细胞群，该峰的大小代表凋亡细胞的多少。本研究通过流式细胞仪分析表明：剂量为100μg/mL的PG-II作用HeLa细胞出现了凋亡峰，使HeLa细胞阻滞于G1期，且随作用时间的延长，细胞凋亡比例逐渐增加，作用24h阻滞作用最明显，凋亡指数可达42.6%。由此可知，珠母贝糖胺聚糖PG-II对人宫颈癌 Hela细胞增殖有抑制作用，其作用机理可能通过诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡而抑制其增殖的。

目前认为细胞凋亡的触发是一个有多种基因参与的级联式表达的结果，药物诱导肿瘤细胞凋亡受一个或多个基因的调控。在细胞凋亡的调控因素中，Bcl-2家族基因备受瞩目，Bcl-2与Baχ基因均属于Bcl-2家族。Bcl-2是抑制细胞凋亡的主要基因，它不仅能抑制肿瘤细胞凋亡，延长细胞存活；而且能拮抗其他抑癌基因所介导的细胞凋亡。Baχ是与Bcl-2作用相反的基因，它的过表达可以拮抗Bcl-2的促进细胞增殖及抑制凋亡的作用[12]；一方面能和Bcl-2形成异源二聚体抑制凋亡，另一方面其自身还能形成同源二聚体诱导凋亡[13]。对多糖抗肿瘤作用机制的研究也表明，Bcl-2/Bax 两蛋白之间的比例是细胞凋亡发生与否的关键因素[14-15]。本研究对其凋亡的分子机制还末做相关研究，需进一步探讨。

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HeLa Cells Apoptosis Induced by Glycosaminoglycan Extracted from Pinctada martensi Dunker

WU Hong-mian，JIN Xiao-shi，FAN Xiu-ping，HU Xue-qiong，ZHONG Min，LEI Xiao-ling (College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

Objective: To investigate the apoptosis-inducing and proliferation-inhibitory effect glycosaminoglycan PG-II extracted from Pinctada martensi Dunker on HeLa cells. Methods: The growth-inhibitory effect was tested by MTT assay. Morphological observations on HeLa cells apoptosis were carried out under inverted microscope and inverted fluorescence microscope. The biochemical changes of HeLa cell DNA during apoptosis were observed by agarose gel electrophoresis. The percentage of apoptotic cells and cell cycle blockage were detected by flow cytometry. Results: PG-Ⅱ could inhibit the proliferation of HeLa cells as determined by MTT assay. Morphological changes in apoptotic HeLa cells were observed under inverted microscope and inverted fluorescence microscope. The agarose gel electropherogram of HeLa cells treated with PG-II for 24 h displayed characteristic DNA ladders from apoptotic HeLa cells with molecular mass between 200 bp and 2000 bp. The results of flow cytometry indicated that PG-Ⅱ could block the HeLa cell cycle at the G1 phase and that the largest blocking effect was achieved after treatment for 24 h at the dose of 100 mg/L with an apoptosis index of 42.6%. Conclusion: PG-Ⅱ can induce apoptosis in HeLa cells and consequently inhibit their proliferation.

glycosaminoglycan from Pinctada martensi Dunker；HeLa cell；apoptosis

R151.1

A

1002-6630(2012)03-0238-05

2011-03-21

广东省教育厅自然科学研究项目( 04J006)

吴红棉(1953—)，男，教授，硕士，研究方向为海洋生物活性物质。E-mail：hxwz247@163.com