A154C/G155C双点突变对嗜热耐酸淀粉酶酶活性及热稳定性的影响

柯 涛，刘 征，杨建伟，牛秋红，惠丰立，石晴芳，马向东

(1.南阳师范学院生命科学与技术学院，河南 南阳 473061；2.湖北大学生命科学学院，湖北 武汉 430062)

A154C/G155C双点突变对嗜热耐酸淀粉酶酶活性及热稳定性的影响

柯 涛1，刘 征1，杨建伟1，牛秋红1，惠丰立1，石晴芳2，马向东2

(1.南阳师范学院生命科学与技术学院，河南 南阳 473061；2.湖北大学生命科学学院，湖北 武汉 430062)

利用重叠延伸法对嗜热球菌Thermococcus sp.的高温酸性α-淀粉酶基因BD5088进行体外A154C/G155C双点定点突变，通过原核表达载体pET30a构建表达载体pET-BD5088C2，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，酶学性质分析表明，突变淀粉酶拓宽了反应pH值范围，尤其是酸性条件下提高更为显著。BD5088淀粉酶在100℃条件下酶活力半衰期约为22min，而突变酶酶活力半衰期40min，突变酶酶活力比BD5088淀粉酶提高近1倍。加热60min时，突变酶酶活力仍可维持原活力的40%，而BD5088淀粉酶只能维持20%左右。说明其热稳定性得到有效的提高。另外，突变酶在中温和90℃条件下酶活力有所提高，65℃时酶活力提高将近1倍。结果表明，BD5088淀粉酶的154、155位残基的突变为Cys对维持其热稳定性起到重要的作用，并且对其酶学性质有较大的影响，可能参与了二硫键的形成。

嗜热耐酸淀粉酶；定点突变；热稳定性；二硫键

淀粉是由葡萄糖基组成的高分子聚合物，是发酵、制糖等工业中最重要的原料之一。现在主要采用的工艺是双酶法，包括两个步骤：液化和糖化，液化过程现广泛采用喷射液化，淀粉大颗粒经喷射液化器，在105～110℃的高温下胶化，淀粉糊的自然pH值为3.5～4.2，因此液化过程需要将pH值调到6.0～6.2。在随后的糖化过程中，糖化酶的最适作用温度、pH值等均与淀粉酶不同。液化之后，需要将pH值调至4.2～5.0，温度降为55～60℃，进入糖化过程。因此，目前对工业用淀粉酶，尤其是燃料乙醇生产专用淀粉酶的研究热点集中在极端嗜热酸性淀粉酶的研究上。

大部分α-淀粉酶属于糖苷水解酶家族GH-13亚家族，尽管淀粉酶家族成员的活性不同，但他们都来自一个共同的祖先，由多结构域组成。所有家族成员都有TIM桶状结构作为催化结构域 (A-domain)[1]。并且所有的酶也都有一个B结构域，位于A结构域的第3个β-折叠和α-螺旋之间。大部分超家族成员的催化结构域有相同的保守区段[2-5]。已知这些保守区域不仅与α-淀粉酶的催化活性有关，而且也与α-淀粉酶家族共有的桶状三级结构的形成密切相关[6-7]。而不同的淀粉酶的B-domain的折叠类型差异较大，长度从34～104不等[8]。

Richardson等[9]从环境微生物DNA文库中克隆到的一系列可能来源于一种嗜热球菌属(Thermococcus)的高温酸性α-淀粉酶基因，并通过定向进化筛选到一个高温酸性α-淀粉酶的人工突变体BD5088，在荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens获得表达。基因BD5088全长1311bp，编码437个氨基酸，蛋白质的理论分子质量约48kD，肽链上不存在任何潜在N-连接糖基化位点[9]。最适pH4.5，最适温度95℃，活性不依赖于Ca2+存在，是一种高温酸性α-淀粉酶，其综合性质均优于其他淀粉酶基因，具有较大的应用潜力。为了能达到生产的目的，提高其热稳定性和耐酸性，本实验前期人工合成了BD5088基因，并在大肠杆菌中表达，研究表明其酶学性质与Richardson等[9]在荧光假单胞菌中获得的重组蛋白有一些差异，其最适温度和pH值范围分别为80℃和pH5.6。以人工合成的BD5088基因为模板，通过蛋白质三维结构和氨基酸序列保守性的分析和其他几个已知的耐高温淀粉酶基因进行同源比对，在可变的B结构域选择待突变的氨基酸位点，利用定点突变技术，进行定点突变，在大肠杆菌中进行表达，验证其酶学性质。

1 材料与方法

1.1 菌种与质粒

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、BL21(DE3)、T载体、大肠杆菌表达载体pET-30α 美国Invitrogen公司。

1.2 酶与试剂

BglⅡ、XhoⅡ、EcoRI、HindⅢ等限制性内切酶、T4DNA聚合酶、T4DNA连接酶、Pyrobest DNA聚合酶、回收试剂盒、抗生素、DNA marker、蛋白质分子质量标准及其他化学试剂 宝生物工程(大连)有限公司；PCR引物合成和测序 上海Sangon公司。

1.3 培养基

筛选培养基是含100μg/mL卡那霉素的LB 琼脂培养基。鉴定淀粉酶活性的培养基是在LB培养基的基础上添加1%淀粉和0.01%曲利苯兰[10]。

1.4DNA的提取及操作

质粒的快速提取、检测及DNA的酶切、连接、大肠杆菌感受态的制备、转化和表达产物的SDS-PAGE分析等按文献[11]进行。

1.5 定点突变及重组质粒pET-BD5088C2的构建和鉴定

根据反向重叠延伸PCR (overlap extension PCR)原理，设计一对突变引物A154/G155f：5＇ATTGCATtgttgtGAC TCCGGAACCTTC3＇和A154/G155rev：5＇GGAGTCacaaca ATGCAATTCATTTGGG 3＇。其中小写字母部分为突变位点。首先，以含有BD5088基因的质粒pET-BD5088为模板，用引物A154/G155f和A154/G155rev，94℃，50s；62℃，45s；72℃，7min (30个循环)，最后，72℃延伸10min，反向扩增得到包含载体序列和基因序列的线性片段，经过DpnⅠ酶消化模板后，胶回收，自连接，转化大肠杆菌DH5α，卡那霉素抗性平板筛选转化子，测序鉴定是否为突变基因，命名该突变基因表达载体为pET-BD5088C2。

1.6 重组蛋白的诱导表达和纯化

将pET-BD5088C2、pET-BD5088和pET30a质粒分别转化E. coli BL21(DE3)，挑取单菌落分别接种于2mL LB (Kanamycin+)液体培养基中，37℃培养过夜，按1%的接种量转接于100mL培养基继续培养到OD值为0.6，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，30℃诱导表达4h后，4℃、12000r/min离心5min收集菌体，将菌体重悬于pH5.6、0.2mmol/L的磷酸缓冲液中，超声波破碎(功率400W，超声10次，每次10s)，4℃、12000r/min离心15min，分别取样用于SDS-PAGE，检测蛋白表达情况。超声波破碎后上清经过90℃加热后，离心去除沉淀，再用固化Ni2+树脂进行纯化后用150mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗脱，即得到纯化的BD5088和双点突变体A154C/G155C重组蛋白。

1.7 淀粉酶酶活力测定

纯化后酶液用Yoo改良法[12]测定酶活力。酶活力单位定义为在最适反应条件下，每分钟水解1mg的淀粉所需的酶量。

1.8 α-淀粉酶酶学性质研究

按照前期实验结果，分别在不同温度、pH5.6条件下测定酶活力，确定其作用的最适温度。分别在不同pH值、80℃条件下测定酶活力，确定其作用的最适pH值。将酶液在95、100℃条件下分别处理不同时间，冰浴后再测定残留酶活力，评价酶的热稳定性。

1.9 序列分析和同源建模

通过BLASTP搜索比对，找出与BD5088高度同源的蛋白质序列和已知三维结构的同源序列，用CLUSTALW程序进行比对。三维结构建模采用已知三维结构的同源序列1MWO为模板，利用SWISS-MODEL程序进行同源建模[13]。利用Compare3D工具进行三维结构间的比较和比对[14]。利用ConSurf-DB工具进行氨基酸序列的进化保守性分析[15]。

2 结果与分析

2.1 定点突变位点的选择

通过序列的同源比对，发现和BD5088高度同源的基因均为古细菌淀粉酶基因，同属糖苷水解酶GH13家族，选取同源序列中已知三维结构的来源于Pyrococcus woesei的淀粉酶基因1MWO，进行三维结构的解析。通过氨基酸序列的进化保守性分析(http://consurfdb.tau.ac.il/, The ConSurf-HSSP database)，可以看出，高度保守的残基大部分位于桶状结构中间。而变异性高的残基一般位于桶状结构的外层、B结构域和C结构域中。从对淀粉酶家族的结构特征分析和催化活性位点分析，发现桶状结构内部尤其是β-折叠内高度保守的氨基酸与淀粉酶催化活性和维持桶状结构的稳定性密切相关。对这些氨基酸的突变往往导致催化活性的丧失。因此，突变目标首先选定为保守性相对较弱的氨基酸区域。

对几个高度同源古细菌酸性淀粉酶间的氨基酸序列比对，BD5088与1MWO、Pfu_amylase、AAM48113分别有86.6%，86.5%和91.3%的同源性，具有较高的序列同源性。同时发现在154、155位点Pfu等3个高温淀粉酶均为2个半胱氨酸，而BD5088淀粉酶则为A154/ G155，位于B结构域中(图1)。根据对1MWO蛋白三维结构解析结果，推测此位点可能参与二硫键的形成，二硫键可加强淀粉酶的热稳定性，而其周围4个氨基酸分别为Zn2+和Ca2+结合位点。因此认为此位点的变化可能影响到该酶的热稳定性等性质，本研究设计该位点为突变位点，构建双位点突变体A154C/G155C，观察该位点对酶活力和热稳定性的影响。

图1 BD5088序列同源比对结果Fig.1 Homologous alignment of BD5088 and other three amylases

2.2 突变基因A154C/G155C的获得

以含有BD5088基因的质粒pETBD5088为模板，用引物A154G155f和A154G155 rev，进行反向重叠延伸PCR，反向扩增得到片段为6.7kb的包含载体序列和基因序列的线性片段(图2)，经过DpnⅠ酶消化模板后，胶回收，自连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选重组子，测序证明获得双位点突变基因A154C/G155C。并获得了含有该突变基因的表达载体pET-BD5088C2。 2.3突变蛋白的的诱导表达

图2 反向重叠延伸PCR扩增产物电泳图Fig.2 Electrophoretic patterns of reverse overlap extension PCR products

将重组质粒pET30a、pET-BD5088C2、pET-BD5088转化到E. coli BL21(DE3)中，获得重组菌株并进行诱导表达，超声波破碎后取样进行SDS-PAGE分析(图3A)，表达出的目的蛋白分子质量约为48kD，大小与理论值一致，经过Ni+树脂纯化，得到纯化后的重组酶(图3B)。 2.4突变高温酸性淀粉酶与BD5088淀粉酶的酶学性质比较研究

图3 表达产物的SDS-PAGE电泳分析Fig.3 SDS-PAGE of amylases from BD5088 and A154C/G155C

在pH5.6，不同的温度条件下，测定BD5088和突变体A154C/G155C的酶活力，获得温度活力曲线。图4A显示，和BD5088淀粉酶相比，二者的最适反应温度范围相似，为70～85℃。60～100℃之间相对酶活力可保持50%以上。突变酶在中温范围的酶活力高于BD5088淀粉酶(图4A)。

在80℃，不同pH值条件下，测定BD5088淀粉酶和突变酶的酶活力，获得pH值-活力曲线，图4B显示，BD5088淀粉酶的最适pH值范围为5.6～6.0，在pH值5～6.4之间，相对酶活力在90%以上，pH值4.6以下失活。而突变酶在pH5.6以上时酶活力特性与BD5088淀粉酶相同，在酸性范围内其酶活力显著优于BD5088淀粉酶，pH4.6时可维持酶活力的78%。

对BD5088淀粉酶进行热稳定性分析，分别在100℃条件下，对酶进行加热处理不同的时间。图4C显示，BD5088淀粉酶在100℃条件下酶活力半衰期约为22min，说明该酶有较好的热稳定性。突变酶100℃条件下酶活力半衰期则提高到40min。加热60min时，突变酶酶活力仍可维持原活性的40%。而BD5088淀粉酶只能维持20%左右。

图4 A154C/G155C、BD5088淀粉酶的酶学性质研究Fig.4 Enzymatic characteristics of amylases from BD5088 and A154C/G155C

2.5 三维结构

BD5088与1MWO氨基酸顺序有86.6%的同源性，三维结构同源建模的结果表明，BD5088淀粉酶和其突变体A154C/G155C在三维结构上与1MWO具有更高的相似度(图5、6)。BD5088淀粉酶和突变酶三维结构区别不大。突变位点位于B结构域，因此对桶状结构影响不大。实验推测突变主要形成了二硫键，二硫键对蛋白结构和功能的贡献主要在于热稳定性上的提高，其温度曲线未发生明显改变。这符合研究热稳定性提高的预期。

图5 突变体的同源建模三维结构Fig.5 3D structure of A154C/G155C obtained by homology modeling

图6 BD5088淀粉酶与A154C/G155C三维结构同源建模后突变位点的比较(局部)Fig.6 Comparison of partial 3D structures of A154C/G155C and BD5088 showing mutation positions

3 讨 论

随着化石能源的日益枯竭和环境污染的日益严重，如何降低利用作物生产燃料乙醇等发酵产品的能源消耗受到了世界各国的高度重视。以淀粉质为原料的液化和糖化工艺的几个主要缺点就是pH值的反复调节、Ca2+的添加、105℃条件下淀粉酶活力的丧失，以及随之而产生的后续处理工艺复杂等问题。解决上述问题的关键就是使用不依赖于钙离子的超高温酸性淀粉酶。显然现有的耐高温淀粉酶不能满足上述工艺改进要求。针对以上特点，国内外对酶品种的改良方面的研究集中在耐高温、耐酸性和非钙离子依赖的淀粉酶的获得上。虽然已经取得了一定的成效，但真正3个特性完全满足、并有高转化率的酶的商品化生产仍然是个空白。而我国的耐高温淀粉酶方面的研制仍无法与同类型国外产品相抗衡。到目前为止，在GenBank中登录的耐酸性耐高温淀粉酶的基因大部分来源于极端嗜热古细菌，在耐高温淀粉酶的生产技术路线方面，现一般都采用基因工程技术手段，经过对极端环境微生物相关基因的蛋白质工程改造，并构建工程菌的技术路线，以避免原宿主菌难以培养或酶活力不高的缺点。目前已得到表达和细致研究，并在3种特性方面完全符合要求的淀粉酶基因还只有两类基因，但距商品化应用仍有距离。因此，对此类淀粉酶的开发首先是相关的基因资源的开发和对现有基因的改造。国内多个课题组在原核和真核表达系统对此类基因进行了表达和研究[16]，但很少有人进行进一步的基因改造工作。

通过对双突变体酶活力的检测，我们发现该位点的突变影响到该酶的温度、pH值特性和热稳定性。两个半胱氨酸的替换可能有利于该区域结构上的稳定，因此该突变体的热稳定性和耐酸性都有所提高。突变酶100℃条件下酶活力半衰期可提高近1倍。而在酸性范围内其酶活力也显著优于BD5088淀粉酶，pH4.6时从BD5088淀粉酶的完全丧失活力提高到可维持最适酶活力的78%。酸性的有效pH值范围从pH4.6扩大到pH3.8，比未突变酶扩大了0.8个pH值。因此该双突变体酶完全符合液化工序中对高温淀粉酶的工艺要求，本研究用定点突变提高淀粉酶热稳定性及扩大酶作用有效pH值范围，将有利于淀粉酶的工业化生产及应用。下一步工作我们可在此突变体基础上进一步选择其他突变位点，以提高其酶比活力等酶学特征，逐步达到生产的要求。

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Effect of Double Site-Directed Mutagenesis on Amylase Activity and Thermostability from Thermococcus sp.

KE Tao1，LIU Zheng1，YANG Jian-wei1，NIU Qiu-hong1，HUI Feng-li1，SHI Qing-fang2，MA Xiang-dong2
(1.School of Life Science and Technology, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, China；2.College of Life Science, Hubei University, Wuhan 430062, China)

Using overlap extension PCR, an A154C and G155C double site mutant named A154C/G155C was constructed based on the thermoacidophilic amylase gene BD5088 from Thermococcus sp. The recombinant plasmid pETBD5088C2 containing A154C/G155C was transformed into E. coli BL21 (DE3) for gene expression. The recombinant A154C/G155C amylase obtained showed a wider range of reaction pH, especially for acidic pH, than the amylase from BD5088. The half-life time of thermostability for the mutant at 100℃ was 22 min, almost doubling when compared with BD5088 (40 min). In addition, after heating for 60 min, A154C/G155C maintained 40% of its original amylase activity compared with 20% for BD5088, indicating an increase in thermostability. Moreover, the amylase activity of A154C/G155C increased at medium temperature or 90℃ and nearly doubled at 65℃. These results together with three-dimensional structure analysis indicate that mutation of the positions 154 and 155 to Cys in BD5088 is of great importance for maintaining the thermostability of amylase, has considerable effect on its enzymatic characteristics and may be involved in the formation of disulfide bonds.

thermoacidophilic amylase；site-directed mutagenesis；thermostability；disulfide bond

Q814.1

A

1002-6630(2012)03-0207-05

2011-02-21

湖北省教育厅重点课题资助项目(D20081004)；河南省教育厅自然科学研究计划项目(2011B180039)；南阳师范学院专项人才启动基金资助项目(nynu200748)

柯涛(1970—)，女，副教授，博士，研究方向为酶工程、分子生物学。E-mail：ketao1@163.com