HSP70-HBsAg基因修饰DC瘤苗抗肝癌作用的实验研究

幸思忠 薛冀苏 李鹤平 赖伏虎 黄呈辉 曾志荣 杨建勇 龙健婷

肝癌为我国常见恶性肿瘤之一，我国每年约有11万人死于肝癌，且发病率有上升趋势。肝癌的免疫治疗是医学领域研究的热门课题。在我国，肝癌的发生与HBV感染密切相关，相关研究已经发现肝癌患者血清乙肝表面抗原（HBsAg）检出率高达90%以上，提示HBsAg是肝癌的重要相关抗原之一。我们以往研究发现，HBsAg修饰的树突状细胞（DC）瘤苗对肝癌荷瘤小鼠产生有较明显的免疫治疗作用，同时能够诱导机体产生一定的抗肝癌免疫保护作用。但这种特异性的CTL效应还不够理想，如何提高DC提呈抗原能力，成为进一步诱导的特异性CTL的关键。已有研究发现热休克蛋白-70(HSP70)参与抗原提呈加工、协同免疫及自身免疫，可能是一种理想的疫苗增效剂［1］。本研究以HepG222.1.5肝癌细胞负荷小鼠模型，通过HSP70-HBsAg嵌合基因的重组腺病毒载体（Ad-HSP70-HBsAg）的介导，探讨HSP70-HBsAg嵌合基因修饰DC瘤苗对肝癌动物模型的免疫治疗效果，以期为HSP70-HBsAg嵌合基因修饰DC瘤苗治疗肝癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物和细胞株

C57BL／6J小鼠，雌性，6～8周龄，购自中山大学实验动物中心。HepG222.1.5细胞系为整合HBV基因的肝癌细胞系，能够稳定表达HBsAg和分泌HBV DNA，由南方医科大学附属南方医院感染科惠赠。

1.2 主要试剂

重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重组小鼠白介素-4（rmIL-4）、重组小鼠白介素-2（rmIL-2）和重组小鼠肿瘤坏死因子（rmTNF-α）购自深圳晶美公司。 RPMI 1640培养液、胎牛血清（FBS）、0.25%胰酶消化液和青霉素/链霉素购自Life Technologies公司。丝裂霉素C（Mitomycin C）、G418、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、刀豆蛋白A(concanavalin, ConA)购自Sigma公司。腺病毒载体Ad-HSP70-HBsAg由本室自行构建［2］。

1.3 小鼠骨髓树突状细胞的体外培养

参考Inaba［3］等方法并稍作改进，拉颈处死C57BL／6J小鼠，无菌取小鼠的股骨、胫骨，用PBS液清洗股骨、胫骨3次。剪开股骨、胫骨的两端，用PBS液冲出骨髓细胞，收集骨髓细胞悬液，用红细胞裂解液(Tris NH4Cl)处理后，于300g（离心力），离心10min。以含10%FBS RPMI-1640培养液调整细胞的密度为2×106/ml，加入到6孔培养板中，每孔2ml，于37℃、5%CO2孵箱孵育2h，轻轻吸弃未粘附的悬浮细胞，用RPMI-1640液冲洗3次去掉未粘附细胞，再加入2ml含细胞因子rmGM-CSF(100ng/ml)和rmIL-4(50 ng/ml)的完全RPMI 1640液，于37℃、5%CO2孵箱中进行培养。隔天半量换液1次，补加细胞因子。于第7天，添加5ng/ml rmTNF-α，继续培养至第12d，收集悬浮细胞为成熟的DC细胞。

1.4 HBsAg--HSP70-DC瘤苗的制备［4］

按上述方法分离小鼠骨髓细胞，进行DC诱导培养，于培养的第5天时加入200μl腺病毒Ad-HSP70-HBsAg(1×107病毒／m1)，于37℃、5%CO2孵箱中进行培养，病毒感染后第一天，将培养液体上清去除，加入含细胞因子新鲜培养液继续培养，以后隔天半量换液1次，继续培养至第10天，收获细胞。

1.5 荷瘤小鼠模型的建立

正常C57BL／6J小鼠随机分成3组（每组10只），将对数生长期的HepG222.1.5肝癌细胞接种于小鼠右后腿根部外侧腿(5×105细胞／只，0.2mL/只)，建立荷瘤小鼠模型，每2～3天观察一次肿瘤生长情况。

1.6 HSP70-HBsAg-DC瘤苗对实验性肝癌的治疗

1.6.1 HSP70-HBsAg-DC瘤苗回输途径比较及对荷瘤小鼠的治疗效果

按1.5方法建立的荷瘤小鼠模型，7d后分别通过瘤体内(intra-tumor)注射，皮下(hypo-derma1)注射或尾静脉(intravein)注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗(1×106细胞／只，0.2mL/只)，7d后再加强免疫治疗1次，每2d～3d观察一次肿瘤生长情况，测量相互垂直的最大径，以面积表示肿瘤大小，记录肿瘤生长曲线。

1.6.2 HSP70-HBsAg-DC瘤苗免疫治疗效果

将对数生长期的HepG222.1.5肝癌细胞接种于小鼠腿部皮下(5×105细胞／只)，随机分3组，每组10只，7 d后采用最佳免疫治疗途径，分别注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗(1×106细胞／只，0.2mL/只)、HBsAg-DC瘤苗(1×106细胞／只，0.2mL/只)、未转染DC瘤苗(1×106细胞／只，0.2mL/只)，7d后再加强免疫治疗1次，每2～3d观察一次肿瘤生长情况，测量相互垂直的最大径，以面积表示肿瘤大小，记录肿瘤生长曲线，共观察36d。

1.7 HSP70-HBsAg-DC瘤苗对实验性肝癌的免疫保护性作用

正常C57BL／6J小鼠随机分成3组（每组10只），经HSP70-HBsAg-DC瘤苗(1×106细胞／只，0.2mL/只)、HBsAg-DC瘤苗(1×106细胞／只，0.2mL/只)、未转染DC瘤苗(1×106细胞／只，0.2mL/只)分别皮下注射免疫2次，间隔7d，于第2次免疫后7d，分别从皮下接种对数生长期的HepG222.1.5肝癌细胞，观察瘤体生长情况,共观察36d。

1.8 统计学处理

使用SPSS12.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均值±标准差(±s)表示，资料采用方差统计分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同途径注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗对荷瘤小鼠模型治疗效果比较

我们首先比较了HSP70-HBsAg-DC瘤苗不同途径回输后的抗肿瘤效应。分别通过皮下、尾静脉、瘤体内注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗对荷瘤小鼠模型治疗，36天内肿瘤大小变化见表1。可以看出，皮下注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗组肿瘤的生长明显缓慢，经方差统计分析，皮下、尾静脉、瘤体内注射三组之间比较有明显差异（F=18.2253，P＜0.01），两两之间比较：瘤苗皮下注射组与瘤体内注射组比较，q＝8.5382，P＜0.01，有明显统计学差异；皮下注射组与尾静脉注射组比较，q＝4.2827，P＜0.01，有明显统计学差异；瘤体内注射组与尾静脉注射组比较，q＝4.2555，P＜0.01，有明显统计学差异。根据统计学结果，皮下注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗组明显优于瘤体内注射组、尾静脉注射，提示最佳免疫治疗途径为皮下注射途径。因此，我们采用皮下注射途径进行下列各项实验研究。

表1 HSP70-HBsAg-DC瘤苗不同途径回输后肿瘤在体内的生长大小比较(mm2)

2.2 HSP70-HBsAg-DC瘤苗皮下免疫治疗效果分析

从表2可见，采用皮下免疫治疗，HSP70-HBsAg-DC瘤苗组肿瘤的生长明显缓慢，HBsAg-DC瘤苗组次之，未转染DC组肿瘤的生长速度最快，提示采用皮下注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗对实验性肝癌有一定的免疫治疗作用。经方差分析，HSP70-HBsAg-DC组、HBsAg-DC组、未转染DC组三组之间比较有明显差异（F=25.8472，P＜0.01），两两之间比较：HSP70-HBsAg-DC组与HBsAg-DC组，q＝3.4595，P＜0.05，有明显统计学差异；HSP70-HBsAg-DC组与未转染DC组比较比较，q＝10.0102，P＜0.01，有明显统计学差异；HBsAg-DC组与未转染DC组比较，q＝6.5506，P＜0.01，有明显统计学差异。因此，采用皮下免疫治疗，HSP70-HBsAg-DC组优于HBsAg-DC瘤苗组、未转染DC组(P＜0.05)。

表2 HSP70-HBsAg-DC、HBsAg-DC、未转染DC回输后肿瘤在体内的生长大小比较(mm2)

2.3 HSP70-HBsAg-DC瘤苗免疫接种后对HepG222.1.5细胞攻击的免疫保护作用

免疫小鼠对HepG222.1.5肝癌细胞再次攻击的抵抗作用如表3所示，HSP70-HBsAg-DC瘤苗免疫小鼠能有效抵抗HepG222.1.5肿瘤细胞的再次攻击，HSP70-HBsAg-DC瘤苗免疫接种后，肿瘤的生长受到明显抑制，瘤体出现延迟，同时生长减慢，HSP70-HBsAg-DC组、HBsAg-DC组、未转染DC组三组间36天内肿瘤大小变化分别为：(11.08±5.61)mm2、(33.12±11.67)mm2、(63.31±28.92)mm2，未转染DC对HepG222.1.5细胞攻击的保护作用明显减弱，而未转染DC组对HepG222.1.5细胞的攻击保护作用很弱，所有小鼠均长出肿瘤。经方差分析，HSP70-HBsAg-DC组、HBsAg-DC组、未转染DC组三组之间比较有明显差异（F=20.5431，P＜0.01）。提示HBsAg-DC瘤苗免疫接种对肝癌细胞有一定的免疫保护作用。

表3 HSP70-HBsAg-DC、HBsAg-DC、未转染DC对HepG222.1.5细胞攻击的免疫保护后肿瘤在体内的生长情况比较(mm2)

3 讨论

近来研究发现，DC瘤苗注射途径对诱导全身性免疫应答意义重大［5-6］。DC瘤苗的输入途径可能决定了细胞免疫能否发生及发生的强弱。有文献报道用111In标记的DC分别经静脉、皮下和皮内途径 注入患者体内，发现静脉注入的DC主要分布于肝脏、脾和骨髓,而皮内注入的DC快速移至局部淋巴结［7］。Fong等［8］将体外致敏的DC分别采用皮内、淋巴管及静脉三种不同的途径输入前列腺癌患者体内，发现三种途径虽然均能诱导抗原特异性T细胞免疫应答,但反应程度各不相同。经皮内和淋巴管途径能产生高水平的TNF-γ，更易诱导Th1 应答，动物实验表明，皮内和皮下注射DC比静脉注射更易诱导CTL反应。皮下免疫DC瘤苗倾向于产生Th1型免疫应答，而静脉注射DC瘤苗倾向于Th2型免疫应答［9］。由于皮下注射使用方便，无输液反应且易诱导Th1应答，是使用DC瘤苗的较好途径。

宋文刚等［10］采用皮下注射、静脉注射和瘤体注射三种途径回输AFP－DC瘤苗，比较观察AFP－DC瘤苗对荷瘤小鼠免疫治疗作用，发现皮下注射AFP－DC瘤苗治疗效果在抑制肿瘤生长、延长小鼠存活期方面都明显优于瘤体内注射或尾静脉注射。我们以往研究发现，采用皮下注射途径注射HBsAg修饰的树突状细胞（DC）瘤苗，对肝癌荷瘤小鼠能够产生特异性的CTL效应，延缓肿瘤的生长，但这种免疫治疗还不够理想，如何进一步这种提高特异性CTL的效应？研究发现DC、巨噬细胞等抗原提呈细胞表面存在热休克蛋白（HSP）受体，热休克蛋白70（HSP70）融合蛋白能够刺激DC上MHCI、MHCII及B7分子水平，还可激活NK细胞，从而进一步达到增强免疫效果的作用。目前，HSP70被认为可能是一种理想的疫苗增效剂。为此，我们前期构建了携带HSP70-HBsAg嵌合基因的重组腺病毒载体，建立了携带HSP70-HBsAg嵌合基因的DC瘤苗，初步实验发现，皮下注射HSP70-HBsAg-DC瘤苗组肿瘤的生长较静脉注射组、瘤体内注射组明显减慢。造成以上结果的可能原因：实验动物皮下免疫DC瘤苗，能够按照预期的目的进人引流淋巴结；实验动物静脉注射DC瘤苗后，DC首先聚集在肺脏、然后是肝脏、脾脏，它们不能有效的进入淋巴结，导致相应T细胞克隆的失能；瘤体注射DC瘤苗后，因肿瘤微环境产生免疫抑制因子影响DC发挥作用。

本实验还发现，HSP70-HBsAg-DC瘤苗皮下免疫的体内抗肿瘤效应明显优于单纯HBsAg瘤苗组和空白对照组，这可能与HSP70作为免疫优势抗原诱导细胞和体液免疫，具有明显的免疫佐剂效应相关［11］。本研究结果显示，HSP70能够增强免疫反应的作用，通过转基因手段诱导抗肝癌肿瘤免疫，可能是一种具有潜在应用前景的生物治疗方法。

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