油茶皂素对茶轮斑病和茶白星病的抑菌作用

崔宏春，周铁锋，余继忠，敖 存，黄海涛，郑旭霞

(浙江省杭州市农业科学研究院 茶叶研究所，浙江 杭州 310024)

茶树病虫害中，病害由于危害影响不直接，且表现不明显，但发生时则会严重影响茶叶的产量和品质，如茶炭疽病、茶轮斑病、茶白星病等茶园病害时有发生，而且由于缺乏相关的研究，目前防治茶树病害的手段极为有限［1］。当前茶园常用的化学杀菌剂不仅存在一定毒性、污染环境、易引起抗药性等问题［2］，而且其仅能起到预防的作用，对已发生病害的茶园则束手无策。一些有机茶园等对化学农药要求较高的茶园则只能采用修剪、焚烧等破坏性的方式处理。油茶皂素，又称茶皂素，是茶籽或油茶饼中提取的一种五环三萜化合物，是一种天然的植物性杀菌剂［3］。由于其源于自然，具有无毒或低毒，对人畜安全，在自然环境下易分解，且不易产生抗性，不仅可以更好的达到杀菌抗病防虫效果，而且对环境更加安全，对茶叶的质量安全也更有保障。

茶轮斑病是茶园中最为常见的一种叶部病害，各产茶区均有分布。在嫩叶、成叶、老叶均见发病，都属高温高湿型病害，分别在5-6月 (梅雨期)和8-10月，秋季发生尤重。病重年份，可引致茶树大量落叶，致使树势衰弱，严重影响次年春茶萌发、产量下降［4］。茶白星病又称白斑病，星点病，国内各茶区均有发生，一般以高山茶园发生较重。主要为害嫩叶、嫩芽、嫩茎及叶柄，以嫩叶为主，重病茶园通常减产20%～30%或更多。病叶制成的干茶，味苦涩，绿茶汤色发红，严重影响成茶品质［5］。

本研究对油茶皂素在茶园常见病害茶轮斑病、茶白星病病原菌菌丝生长和孢子萌发等的抑制效果进行了研究，并进行了室内盆栽实验，明确了油茶皂素对在茶园中常见病害茶轮斑病、茶白星病病原菌的抑菌效果，为无公害茶园植物性农药开发进行了探索。

1 材料与方法

1.1 供试材料

90%茶皂素原粉购自浙江省东方茶叶科技有限公司，病叶采自西湖区龙坞渤兰湾农场。

1.2 试验处理方法

1.2.1 供试植物病原菌分离及培养

在茶园病害发病高峰期时采集病叶，采用组织分离法［6］分离病原菌，用经过3次火焰灭菌的镊子将病叶移入培养皿中，将培养皿翻转放在26～28℃恒温箱内培养。3～4 d后，挑选典型而无杂菌接近的菌落，在其边缘用移菌针挑取带有菌丝尖端组织的培养基一小块，移入新的PDA培养基中，用连续稀释培养法对菌株进行纯化，获得纯培养菌株。

1.2.2 油茶皂素对病原菌菌丝生长的抑制作用

采用菌丝生长速率法测定［7］油茶皂素对菌丝生长的抑制性。将油茶皂素用无菌水配制成一系列浓度 的 母 液 (0，10，30，50，80，100，120mg·mL-1)，分别取一定量的母液加入到已用微波炉溶化的50℃左右的定量的PDA中，并加入微量链霉素 (抑制细菌生长)，趁热充分摇匀后倒入无菌培养皿中，制成含药PDA平板，每个浓度重复3次;待平板冷却表面风干以后，用直径0.5 cm打孔器提取已培养好的新鲜的菌饼，菌丝面朝下接种到平板中央，盖上皿盖，置于相应的温度下恒温培养，用无菌水作对照，整个操作过程在无菌条件下进行。72 h后用十字交叉法测量菌落直径，按公式计算抑制率。

菌丝生长抑制率/%=(对照菌落生长直径-处理菌落生长直径)/对照菌落生长直径×100。

1.2.3 油茶皂素对病原菌孢子萌发的抑制作用

把茶轮斑病菌和茶白星病菌接种在PDA培养基上，恒温培养1周后，用PDA培养液的稀释液洗下孢子，四层纱布过滤后，配成一定浓度的孢子悬浮液 (显微镜下每视野100个孢子)，将不同浓度的药液 (0，10，30，50，80，100mg·mL-1)与孢子悬浮液各取50μL混和滴加于干净的单凹片上，置于保湿培养皿内，并于相应温度下分别培养8 h和24 h后，镜检孢子萌发情况，计算孢子萌发抑制率［8］。

1.2.4 油茶皂素对温室茶苗茶轮斑病和茶白星病药效

参照农药田间药效试验准则GB/T 17980.1～17980.53—2000，用茶籽培育出的温室茶苗进行温室盆栽试验，测定油茶皂素对茶轮斑病和茶白星病的抑菌活性。具体研究内容如下:选用当年成熟的茶籽，浸种24 h，用强氯精消毒8 h，杀灭种子上带着的杂菌，保证茶苗长势良好。25℃下催芽48 h，选取芽长一致的茶苗种于塑料盆中，用珍珠岩覆盖，置于温室中培养。2个月后，选用室内盆栽长势一致的茶苗 (1心4，5叶)，用配置好的茶轮斑病病原菌和茶白星病病原菌的孢子悬浮液，喷雾接种到茶苗上［9］，在 8℃，空气相对湿度(RH) ＞95%的黑暗条件下培养24 h，然后将用无菌水配制好的100mg·L-1油茶皂素溶液对接种茶轮斑病菌的茶苗和接种茶白星病菌的茶苗进行喷雾，药量以喷至叶片开始滴水时为准。将茶苗置于(28±2)℃，RH＞95%，光照周期12∶12 h(L∶D)的条件下培养，1周后当对照明显发病时，调查感染叶片并分级，计算防治效果。

病情指数分级标准［10-11］如下:0级为无病斑，1级病斑占叶面1/4以下，2级病斑占叶面1/4～2/4，3级病斑占叶面2/4～3/4，4级病斑占叶面3/4以上。

病情指数=∑ (各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)×100。

防治效果/%=(CK– YP) ×100/CK(CK为对照施药后病情指数，YP为施药后病情指数)。

2 结果与分析

2.1 对病原菌菌丝生长的抑制作用

研究结果表明，油茶皂素对茶轮斑病菌及茶白星病菌的菌丝生长均有较明显的抑制作用，随着油茶皂素溶液浓度的升高，对2种菌丝生长的抑制率也升高 (表 1，2)，EC50分别为 30.20和 17.38mg·mL-1，毒力回归方程如表。油茶皂素对茶白星病菌菌丝生长的抑制好于茶轮斑病。

2.2 对病原菌孢子萌发的抑制作用

研究结果表明，前8 h内油茶皂素对茶轮斑病和茶白星病孢子均有很强的抑制作用，当对照孢子萌发达90%以上时，加药的茶轮斑病菌孢子均未萌发;而茶白星病菌孢子加药浓度为10mg·mL-1的有少量萌发，浓度30mg·mL-1以上的均未萌发，为萌发的孢子颜色呈深褐色，颜色明显深于对照。24 h后加药浓度为10mg·mL-1时，个别已经萌发的茶轮斑病菌孢子的菌丝生长较对照出现明显差异，菌丝短而且粗，颜色较深，并且随着给药浓度的增高，孢子萌发率也相应降低，萌发孢子的菌丝也相应的减短;而加药浓度为30mg·mL-1以上的茶白星病孢子生长较对照才出现明显差异，随着给药浓度的增高，孢子萌发率和萌发孢子的菌丝也相应呈递减趋势，并且给药浓度增大到80mg·mL-1时，孢子萌发率和萌发孢子的菌丝的递减趋势终止。

2.3 对茶轮斑病和茶白星病的温室盆栽药效

研究结果表明，油茶皂素对茶轮斑病和茶白星病具有一定的防治效果，浓度100mg·mL-1的油茶皂素药液对茶白星病的防治效果较好 (表2)，达88.06%。

表2 油茶皂素对茶轮斑病和茶白星病的防效

3 小结

本文通过菌丝生长速率法测定油茶皂素对茶轮斑病原菌、茶白星病原菌菌丝生长及对这2种病原菌孢子萌发的抑制作用，初步得出油茶皂素对2种常见病害的病原菌有较好的抑菌作用，对其病原菌丝生长的抑制EC50分别为30.20和17.38mg·mL-1;并且，随着油茶皂素溶液浓度的增加，抑制率也升高。油茶皂素能较好地抑制2种病菌的孢子萌发，特别是对茶轮斑病菌的孢子萌发抑制效果较好，低剂量给药即可短时间内抑制其孢子萌发。室内盆栽实验结果表明油茶皂素对茶轮斑病和茶白星病具有一定的防治效果，100mg·mL-1的茶皂素药液对茶白星病防效达88.06%，对茶轮斑病的防效达74.58%。通过以上研究，可以看出油茶皂素对2种茶园常见病害有一定的防治效果，油茶皂素可以作为茶园植物性杀菌剂用于防治茶轮斑病和茶白星病。

［1］邵鑫.茶炭疽病的发生及其防治 ［J］.蚕桑茶叶通讯，2001(1):14.

［2］郝彩琴.植物源农用抑菌活性成分研究综述研究 ［J］.河北农业科学，2008，12(11):62-65.

［3］崔宏春，余继忠，周铁锋，等，油茶皂素的活性及其应用研究进展 ［J］.浙江农业科学，2011(3):593-598.

［4］杨发军.茶树病虫害的发生以及综合防治 ［J］.云南农业，2002(4):16.

［5］周玲红，邓欣.我国茶白星病研究概况 ［J］.蚕桑茶叶通讯，2007(2):21-23.

［6］张国辉，张文华，刘冬莲.八月瓜炭疽病的病原菌鉴定及病害分析 ［J］.中国农学通报，2011，27(13):277-280.

［7］郝彩琴，杜晓峰，庄世宏，等.小花假泽兰精油化学成分及其抑菌活性初步研究 ［J］.西北植物学报，2007，27(10):2097-2013.

［8］郭新春.38种中药提取物对4种植物病原菌抑制活性的初步研究 ［D］.吉林:东北师范大学，2006.

［9］洪永聪，来玉宾，叶雯娜，等.枯草芽孢菌株 TL2对茶轮斑病的防病机制 ［J］.茶叶科学，2006，26(4):259-264.

［10］李佛龙，王健，魏周玉，等.生物农药防治蔬菜白粉病叶霉病试验 ［J］.甘肃农业，2006(1):212-213.

［11］谌江华，柴伟纲，孙梅梅，等.几种新型药剂对樱桃番茄灰霉病的田间药效试验 ［J］.长江蔬菜，2009(2):75-77.