中药通窍明目IV号对实验性青光眼视觉诱发电位的影响

孙 河 董霏雪

通窍明目IV号来源于我们治疗青光眼视神经损害的中药经验方，多年的临床观察表明，该药对青光眼视神经损害具有较好的治疗作用〔1〕，但尚缺少相关的基础研究，限制了其在青光眼视神经保护方面的深入开发和应用。视觉诱发电位（visual evoked potential，VEP）是视网膜感光细胞受到刺激产生的一种电生理活动，其P1波峰值、潜伏期是反映视神经功能状态最为可靠和敏感的指标。在本研究中，我们以高眼压后经手术眼压恢复正常的动物模型为研究对象，观察了通窍明目IV号对兔闪光视觉诱发电位（flash visual evoked potential，F-VEP）的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与分组：纯种日本大耳白兔55只，体重 2.5～3.5 kg，雌雄兼用，兔龄为 12～16个月，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。选取其中45只造模。其余10只作为空白对照组。将造模成功后经手术治疗眼压恢复正常的40只动物模型分层随机分为模型组、模型治疗Ⅰ组（给予低剂量通窍明目Ⅳ号）、模型治疗Ⅱ组（给予中剂量通窍明目Ⅳ号）、模型治疗Ⅲ组（给予高剂量通窍明目Ⅳ号）。

1.1.2 主要仪器和试剂：TONO-PEN笔式眼压计（型号 XL，美国 Medtronic solar公司）；GT-2000NV视觉电生理检测仪 （重庆国特医疗设备有限公司）；眼科显微手术器械、眼科手术显微镜（苏州医疗器械设备厂）；卡波姆-940（批号：20040813，购自北京国人逸康科技有限公司）；戊巴比妥钠溶液；0.4%盐酸奥布卡因滴眼液眼液（倍诺喜）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的制备：实验兔双眼进行实验，造模前2%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉（20mg/kg），0.4%倍诺喜滴眼液滴眼行表面麻醉，造模眼在抽取房水0.15 ml后，留置针头，再向前房内注射同等剂量0.3%复方卡波姆。每日用TONO-PEN眼压计测量眼压1次。慢性高眼压模型造模成功的标准为：眼压＞22 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），并维持 20 d。 造模期间如眼压＜22 mmHg，重复注药1次。慢性高眼压维持28 d后行小梁切除术。在巩膜瓣完成后于瓣下角膜缘切开一小口，缓慢放出房水，眼压下降后冲洗前房，行小梁切除、周边虹膜切除术，术后结膜下注射庆大霉素0.5万单位，将眼压降至正常（＜21 mmHg）。术后给予抗生素眼药膏涂眼，预防感染。

1.2.2 实验药品制备及给药：通窍明目Ⅳ号由柴胡、葛根、当归、郁金等中药按一定比例配伍而成，药物由黑龙江中医药大学附属第一医院药剂科提供，黑龙江中医药大学制剂室加工成浓度为每1 ml含生药1 g的混悬液，密封，4℃保存备用。空白对照组、模型组兔用生理盐水灌胃，剂量为 4 ml·kg-1·d-1。模型治疗Ⅰ组、模型治疗Ⅱ组、模型治疗Ⅲ组予通窍明目Ⅳ号灌胃， 剂量分别为 3 g·kg-1·d-1、6g·kg-1·d-1、12g·kg-1·d-1，即按照体表面积计算法，分别相当于成人等效治疗量及2倍、4倍治疗量。模型动物于术后眼压恢复正常后开始给药，空白对照组同步给药，每日1次，持续1个月。

1.2.3 F-VEP的检查方法：所有兔均在麻醉状态下于暗室内进行F-VEP检查，实验特定支架固定动物，引导电极由两耳连线中点插入枕外粗隆上方骨膜下，参考电极插入额部两眼连线中点下，接地电极置于右耳后皮下，经鳄鱼夹联线将信号输入测试仪。兔眼距屏幕30 cm，暗适应10 min后开始记录。采用全视野刺激球白色闪光刺激，背景无色，刺激模式为单刺激，频率2 Hz，刺激次数50，每次采样时间500 ms，波形叠加100次，连续测量至少2次，每次间隔10 min，记录稳定波形2次。双眼检测，当检查动物一眼时，用不透光眼罩完全遮盖对侧眼。本实验所用的电极由针灸针改造而成，操作时注意勿使电极损伤动物的脑组织。F-VEP的检查时间为给药后1个月，以P1波幅值（μV）和潜伏期（ms）为观测指标。

1.3 统计学处理

实验数据应用SPSS 16.0软件包进行分析，慢性高眼压造模前后与对照组比较用t检验，多组之间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 高眼压模型兔的眼压

造模前空白对照兔和拟造模兔的眼压分别为（14.60±3.17）mmHg，（14.37±2.77）mmHg，差异无统计意义（P>0.05）；造模兔前房注入卡波姆4周后眼压升高到（36.36±7.66）mmHg，明显高于同期的空白对照兔，差异有统计学意义（P＜0.01）（表1）。 说明前房注入卡波姆的方式可以有效建立高眼压实验动物模型。

表1 高眼压模型兔与空白对照兔的同期眼压比较（±s，mmHg）

表1 高眼压模型兔与空白对照兔的同期眼压比较（±s，mmHg）

注：与空白对照兔比较，①P<0.01（两独立样本t检验）；1 mmHg=0.133 kPa

组别 眼数/只 测量眼压时间模型兔造模前 模型兔造模后4周高眼压模型兔 90 14.37±2.77 36.36±7.66①空白对照兔 20 14.60±3.17 14.8±2.67

2.2 模型组与模型治疗组小梁切除术后眼压比较

施行小梁切除术后，模型兔有6只眼眼压未能控制，2只眼睛出现前房出血，2只眼脉络膜脱离，予剔除。我们将剩下的40只随机分模型组、模型治疗Ⅰ组、模型治疗Ⅱ组、模型治疗Ⅲ组。每组10只（20只眼），随后我们又对各组小梁切除术后的眼压恢复情况进行统计，结果显示各组眼压无明显差异（P>0.05）（表 2）。

表2 各组小梁切除术后眼压情况（±s，mmHg）

表2 各组小梁切除术后眼压情况（±s，mmHg）

注：各组比较，P＞0.05（单因素方差分析）；1 mmHg=0.133 kPa

组别 眼数/只 小梁切除术后眼压模型组 20 16.80±2.07模型治疗Ⅰ组 20 17.00±2.66模型治疗Ⅱ组 20 16.95±2.59模型治疗Ⅲ组 20 16.00±2.62

2.3 F-VEP检查

2.3.1 P1波潜伏期：模型组及各模型治疗组的P1波潜伏期较空白对照组延长，差异有统计学意义（P＜0.01）；模型治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组的P1波潜伏期较模型组缩短，差异有统计学意义（P＜0.01）。各模型治疗组间比较，Ⅰ组的潜伏期较Ⅱ、Ⅲ组长（P＜0.05），但Ⅱ、Ⅲ组之间无统计学意义的差异（P＞0.05）（表 3）。

2.3.2 P1波振幅：模型组及各模型治疗组的P1波振幅较空白对照组降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；模型治疗Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组的P1波振幅均较模型组升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。各模型治疗组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表 3）。

表3 各组兔F-VEP P1波振幅及潜伏期比较（±s）

表3 各组兔F-VEP P1波振幅及潜伏期比较（±s）

注：与模型组比较，①P<0.01；与空白对照组比较，②P<0.01；与模型治疗I组比较，③P<0.05（单因素方差分析）

组别 眼数/只 P 1波潜伏期/m s P 1波振幅/μ V空白对照组 2 0 3 4.4 5±3.1 9① 1 7.7 9±3.4 2①模型组 2 0 5 0.5 2±2.8 4② 9.7 7±2.6 4②模型治疗Ⅰ组 2 0 4 7.2 4±2.3 7①② 1 3.1 3±3.4 7①②模型治疗Ⅱ组 2 0 4 5.3 8±3.3 6①②③ 1 3.5 2±2.5 6①②模型治疗Ⅲ组 2 0 4 4.8 4±2.7 1①②③ 1 3.2 0±2.6 7①②

3 讨论

青光眼是一种发病机制复杂，以视野缺损、视神经萎缩为主要临床表现的高致盲眼病。若得不到恰当治疗最终会导致失明。传统观点认为高眼压是引起青光眼失明的主要危险因素，而我们在临床上发现很多患者的眼压虽然控制正常，但视野损害仍在继续。国外资料显示约有1/7的青光眼患者，在其眼压控制良好的7年中，视野缺损仍然在持续增加。20%的青光眼患者眼压虽然下降了30%，但在其后的3~5年时间里病情仍然在继续发展〔2〕。这表明即使眼压得到了有效控制也不能完全阻止青光眼视神经损害的发生，在降低眼压的基础上，还应注重和加强对视神经的保护。

通窍明目Ⅳ号为临床经验方，组成药物有柴胡、葛根、当归、郁金等，以疏肝解郁，开窍明目，化瘀散结通络为主要立方原则。课题组从1998年至今，不断观察通窍明目Ⅳ号治疗青光眼视神经损伤的疗效。肯定疗效后，又对适应症、禁忌症进行筛选，并于2002年开始较为系统地与西药和中西药结合疗法进行对比研究，结果证实了通窍明目Ⅳ号的临床治疗价值〔1〕。大量临床研究表明，通窍明目Ⅳ号对于青光眼引起的视神经损害，具有提高视力、扩大视野的作用，且无不良反应。

人眼青光眼视神经损害在VEP上表现为振幅降低，潜伏期延长，青光眼视神经损害越严重，VEP的相应改变也就越明显。研究〔3〕认为VEP潜伏期的长短可以反映视神经髓鞘功能状态，波幅的高低反映轴索功能状态。刘婉莹〔4〕等建立SD大鼠轻、中、重度视神经不完全损伤模型，并记录视神经正常及损伤后大鼠F-VEP潜伏期和振幅的变化，发现大鼠损伤后F-VEP的变化规律与神经损伤程度一致，并认为F-VEP是客观反映视神经功能的一项可靠指标。马建州等〔5〕在观察高眼压模型大鼠F-VEP变化的研究中发现，模型建立2个月时AP1（N1-P1振幅）降低，至第6个月是仍未恢复；LP1（P1波潜伏期）在造模第2个月时未见明显变化，到第6个月时则出现明显延迟，认为F-VEP的改变与视网膜神经节细胞减少和视神经纤维密度减低相吻合，F-VEP可以客观反映高眼压模型的视功能状态。另外，有人根据VEP波幅的下降程度，估计视神经损伤的预后。国内临床研究〔6〕显示，当F-VEP波幅降低超过健眼68%或消失时，治疗效果不佳，预后不良；当F-VEP振幅降低幅度小于健眼的55%时，经过积极治疗，可有较好预后。Akabane等〔7〕的研究结果相比国内更为保守，认为如果重要波形的波幅下降超过50%，即可认为视神经的损伤不可逆。

由于P1波的振幅和潜伏期会受实验条件、刺激和记录方法、动物个体间差异的影响，F-VEP值没有一个统一的标准值，所以我们在实验中以自身作为对照，探寻药物对VEP的影响。

本实验中，模型组及各治疗组的VEP结果均较空白对照组差（P＜0.01），而治疗组的P1波潜伏期、振幅又较模型组有明显改善（P＜0.01），这一方面说明卡波姆诱导的高眼压已造成了对视神经的损伤，模型制作是成功的，另一方面则提示通窍明目Ⅳ号对青光眼引起的视神经损害具有一定的保护作用。从药物的量效关系上看，各剂量治疗组的差异主要表现在P1波潜伏期方面：模型治疗Ⅱ组、Ⅲ组的潜伏期均较Ⅰ组缩短（P＜0.01），各治疗组间P1波振幅则无明显差异（P＞0.05）。提示就VEP潜伏期而言，中、高剂量通窍明目Ⅳ号的视神经保护作用较低剂量明显。

总之，本实验研究表明高眼压因素确实造成了兔的视神经损害，并可能伴随有视神经髓鞘及轴索功能状态的改变，从而影响神经冲动的传递而使P1振幅下降、潜伏期延长。通窍明目Ⅳ号可能是通过改善视神经髓鞘、轴索功能状态，修复部分已经受损的视神经，起到保护视神经的作用。至于该作用与给药剂量的大小是否存在确切关联，尚有待今后进一步的实验研究来明确。

[1] 吴玲玲，孙河.通窍明目IV号对青光眼视神经保护机制的实验研究[D].哈尔滨：黑龙江中医药大学，2008.

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[3] 潘映福.临床诱发电位学[M].北京：人民卫生出版社，1988：375.

[4] 刘婉莹，张卯年，陈兵，等.SD大鼠视神经不同程度损伤的闪光视觉诱发电位动态监测[J].解放军医学杂志，2004，29（5）；439-440.

[5] 马建州，贺翔鸽，谢琳，等.慢性高眼压模型大鼠闪光视觉诱发电位改变的实验研究[J].第三军医大学学报，2007，29（22）：2182-2184.

[6] 蔡莉，惠延年，郭守一.严重视神经损害后视觉诱发电位变化分析[J].眼外伤职业眼底病杂志，1999，12（6）：407.

[7] Akabane A，Saito K，Suzuki Y，et al.Monitoring visual evoked potentials during reaction of the canine optic nerve：protective effect of unroofing the optic canal[J].Neurosurg，1995，82（2）：284.