天麻共生蜜环菌母种及液体种培养基的优化*

刘 冰，牛 芸，张德著，张汉波，杨明挚**

（云南大学生命科学学院，昆明 650091）

蜜环菌以菌索的形式侵入天麻营养繁殖茎并被同化，是天麻无性繁殖阶段的唯一营养源[1]。在生产流程上，天麻种植用蜜环菌菌种分为三级：母种 （一级）、原种 （二级）和栽培种 （三级）。从天然环境中分离纯化得到的母种经扩大培养成为生长旺盛的原种，再接种于固体培养料形成用于转染菌材的栽培种。一级、二级菌种的质量好坏影响到三级菌料及菌材上菌索健壮程度及多寡，而后者则直接决定了天麻的质量和产量[2]。目前常用固体PDA加富培养基培养母种，蜜环菌虽能在其基质中生长但存在菌丝易于老化、菌索细弱长势差等缺点[3]。原种则多采用木屑培养基或液体PDA加富培养基[1-2]。然而目前液体培养方法主要集中于工业发酵领域，研究所得的培养基和培养条件不适合在天麻种植户中推广。本试验拟在现有研究成果上针对母种及原种培养基进行优化，以期筛选出菌丝体性状优良且高产的固体母种配方和适应农业生产实际的液体原种配方。

1 材料与方法

1.1 材料

直径1cm及以下板栗细小枝条 （Castarea mollissima）和玉米芯采自昆明市郊。马铃薯购自市场，其余试剂类均为国产分析纯。普通型及加富型PDA培养基 （固体型及液体型）配方参考徐锦堂[1]、兰进[2]等。自昭通彝良小草坝采集的腐烂木材韧皮部中分离得到的蜜环菌 (Armillaria mellea)菌株，利用ITS序列进行分子鉴定后，保存于普通PDA培养基上备用。

1.2 方法

1.2.1 母种培养

切取约0.5cm3大小的供试菌株菌块接种于装有20 mL加富型固体PDA斜面试管 （18 mm×180 mm）中。25℃恒温暗箱培养30 d，培养基内长满白色粗壮菌索后待用。

1.2.2 液体菌种制备

截取高度2 cm上述含菌索母种，尽量剔除附着的半固体培养基后充分剪碎。接种于含125 mL加富型PDA液体培养基的250 mL三角瓶中。置于旋转式摇床28℃恒温、120转·min－1摇瓶培养3 d至菌液呈浅红色待用。

1.2.3 母种固体培养基正交优化

参考彭述敏等[4]、程显好等[5]的单因素营养条件筛选结果，选取葡萄糖、酵母浸粉和无水乙醇作为影响因子。设计3因素3水平的正交试验 （表1），并按表1配制9个试验号的培养基，并设固体PDA加富培养基为对照组。灭菌后每20 mL培养基倒入直径9 cm平板，每试验号5皿重复。 每皿接种1.2.2中培养 3 d的液体菌液 0.2 mL并涂布均匀。测定25℃恒温培养13 d后的生物量及菌丝体性状。

表1 正交试验的因素及水平

1.2.4 液体原种培养基制备及优化

将原材料在65℃下烘干并剪成1 cm～2 cm的小段。称取100g原材料碎段，加水1 000 mL煮沸30 min，纱布过滤后灭菌保藏。在100 mL三角瓶中分别添加10 mL、20 mL、30 mL和40 mL板栗枝条煮汁，用普通PDA培养基母液补齐至50 mL。采用玉米芯煮汁和蒸馏水代替上述板栗汁，得到三个系列四个梯度 （20%、40%、60%、80%）的培养基，每组三次重复。121℃高压灭菌后，每瓶接种1.2.2中培养的液体菌种4 mL。测定室温、黑暗条件下摇瓶25天的生物量。比较各组差异，确定原料煮汁的最适添加量。根据上述实验所得结果，在添加剂总量为30 mL下将板栗煮汁和玉米芯煮汁进行组合。100 mL三角瓶中分别加入板栗煮汁0、10 mL、15 mL、20 mL和 30 mL，用玉米芯汁补足30 mL。每组再加20 mL普通PDA母液，得到五组不同浓度比 （0∶3、 1∶2、 1∶1、 2∶1、 3∶0）培养基。另设50 mL液体加富PDA作为对照，各组均3次重复。接种菌液4 mL，测定室温黑暗摇瓶15 d后菌丝体性状及生物量。

1.2.5 碳源的选择优化

根据1.2.3中结果，用蔗糖等量替换PDA母液中葡萄糖制成PSA母液。在100 mL三角瓶加入30 mL组合添加剂 （板栗液：玉米芯液=1∶1），再分别添加20 mLPDA母液和PSA母液。接种菌液4 mL,测定室温黑暗摇瓶15 d后菌丝体特征及生物量。比较不同碳源对菌体生长的影响。

1.2.6 菌丝体的生物量测定方法

固体培养所得单菌落切下置于80℃水浴中5 min，使菌索附着的培养基充分溶解；液体培养所得菌丝球用4层纱布过滤，并用蒸馏水冲掉附着的培养基。转移至已知质量的滤纸上，置于65℃烘箱中烘干至恒重，分析天平称重。

1.2.7 数据处理

参考唐启义等的方法[6]，采用DPS数据处理系统 V3.01进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 母种培养基正交试验结果

正交试验结果及分析列于表2和表3。其中干重最高为8号。极差RC>RB>RA，影响因素主次为：C（乙醇）＞B（酵母膏）＞A（葡萄糖），且C与B之间差异极小。直观分析最佳组合应为A1B3C3。A1B3C3为3号培养基，但干重不及8号 （A3B2C2）。从生物量角度考虑，最佳组合应为A3B2C2 （表2）。

表2 L9（33）正交试验结果

方差分析显示，酵母膏、葡萄糖和乙醇对菌体生长均无显著影响 （FA＜FB＜FC＜F(6,2)0.05）。 同时误差平方和SSe过大，占总平方和的32%，推测三因素之间可能存在交互作用。故无法用正交方差分析结果进一步优化组合（表 3）。

表3 正交试验方差分析表

将培养基组合做单因素分析，各培养基菌丝体性状及生物量见表4。8号、3号和5号所得菌丝体干重分列前三位，三者所得菌丝体性状一致。8号和3号的干重与其余各组存在极显著差异。其余各组间 （含对照组）菌丝体干重均无显著差异，但所得菌丝体的性状存在差异 （表4）。

2.2 板栗和玉米芯提取液对蜜环菌菌丝体生物量的影响

不同比例添加剂的培养基在室温摇瓶培养25 d后获得的菌丝生物量及其方差分析结果列于表5。添加同种成分在不同比例间所得菌丝体干重差异极显著 （F板栗液=684.757＞ F 水 =239.84＞ F 玉 米 芯 液 =181.451＞F(8,3)=8.85）。板栗液比例在20%、40%和60%都对菌体量增加有极显著促进。玉米芯提取液只有在添加到40%和60%才显著促进菌丝体增重。其中在本次单因素实验中当板栗枝叶提取液添加到60%时以及玉米芯提取液添加到40%时对密环菌菌丝体生长促进作用分别达到最大值。比较两者的促进生长效应，在任何添加比例下板栗枝叶提取液对密环菌的促生长作用均显著优于玉米芯提取液 （表5）。

表4 各试验号菌丝体属性及方差分析

表5 不同比例的板栗枝叶和玉米芯提取液添加队菌丝体生物量的影响

2.3 两种添加成分组合与优化

同时添加板栗枝和玉米芯提取液，不同比例的混合组合对密环菌菌丝体生长的促进作用有差异。其中添加比例为1:1时的生物量最高，3:0组次之，二者与其它各组均达到极显著差异。使用添加剂组合获得菌球比加富型PDA的个体更大，在菌球颜色和老化情况方面均有不同程度的差异 （表 6）。

2.4 碳源选择优化结果

在上述实验结果的基础上，分别探讨了葡萄糖和蔗糖作为碳源的培养结果，发现葡萄糖组和蔗糖组在产量上的差异并不明显。所得的菌球在个体大小和数目都较一致。除蔗糖组的颜色稍浅外，其它特征均与葡萄糖组相同（表7）。

3 讨论

伴栽天麻的蜜环菌菌株宜选择菌索粗长、分支多、生物量大、健壮度高的菌株，这样的菌株侵染机率高并能长期供给予天麻充足的营养[1]。生产用菌株的质量不仅取决于母种的遗传属性，还有赖于培养基质的营养条件。本试验所得最佳固体母种培养基配方 （每升培养基含葡萄糖25 g、 酵母粉 2 g、 乙醇 5 g、 K2PO43g、 MgSO41.5g、 VB110 mg及琼脂15g）与目前广泛使用的固体PDA加富培养基相比，菌丝体长势更好，产量达2倍以上。同时菌索性状优良，更适合用于天麻栽培；菌丝老化程度低、不易核化，更符合长期保藏的需求。

彭述敏等[4]的单因素营养条件筛选结果显示，葡萄糖和酵母膏分别是2株昭通本地天麻共生蜜环菌生长的最优碳源和氮源。程显好等[5]发现向培养基中在适宜的范围内增加乙醇浓度能显著促进蜜环菌菌丝体产生。Weinhold研究了乙醇作为有机生长因子，少量 （0.05%）添加至以0.5%葡萄糖作为唯一碳源的培养基上，可以显著促进菌丝的旺盛生长和菌索的大量产生[7]。由于本试验中各因素间可能存在互作，乙醇对菌丝体生长的促进作用可能是影响了蜜环菌对葡萄糖或酵母膏的吸收以及菌体内的代谢过程。应在本试验因素水平上设计L18（37）正交试验 （增加因素A×B和A×C），确定互作发生的位置，这对揭示乙醇的作用机理有一定意义；并利用正交方差分析确定最高产组合，同时结合菌丝体性状考察，进一步优化母种配方。

表6 2种添加剂组合对菌体特征及生物量的影响

表7 不同碳源对菌丝体特征及生物量影响

二级菌种的作用是在三级固体菌料或菌枝上继续扩大培养。采用液体摇瓶方式培养二级菌种较之传统以树叶木屑为基质的固体培养方式，产生的菌丝体生长点多、菌龄一致，接种于三级培养料后生长速度快、分布均匀[1－2]。从生产角度看，液体菌种培养成本低、原料利用率高，易于实现大规模生产。液体二级菌种以菌球个体大，菌丝结合紧密，健壮度高为优。这样的菌种抵抗不利环境能力强，在新营养条件下的适应期短，菌丝萌发快；同时单位体积内菌丝量多，培养三级菌料的周期短[8]。

蜜环菌在自然环境中往往生长在壳斗科植物茎干或根部，也有报道称采用玉米芯介质能成功培养蜜环菌。板栗提取液中促进菌丝体增殖有效成分可能是无机盐类和酚类化合物。蜜环菌生长需要大量的锰、磷、钾和硫元素。自然条件下板栗枝条贮存着较高水平氮 （0.6%）、磷（0.2%）、 钾 （0.3%）元素以供给果实的营养积累[9]，在人工施肥情况下含量则更高。果树韧皮部含有的某些酚类化合物被证实可以刺激菌索的生成[7]。玉米芯中含58.4%的可溶性碳水化合物和2.0%粗灰分[10]，可作为有效碳源和无机盐的补充。两种提取液组合使用的效果比单独添加好，可能是丰富了营养物种类并辅助或刺激了基础营养物吸收利用。

实验获得蜜环菌液体原种培养基 （每升培养基含马铃薯80 g、蔗糖8 g、板栗枝段 30 g、玉米芯碎块30 g），培养所得菌丝体产量高，菌球数目多、个体大、健壮度高。在各指标上均优于目前常用的加富型PDA液体配方，同时节约马铃薯和糖各60%。该配方成本低、原料易得、操作简单，适合用于实际农业生产。板栗是云南省广泛栽培的经济作物，每年因避免果树徒长会产生大量的修剪枝条。玉米芯也是广泛而廉价的原料来源。而这部分农业废弃物由于可利用力面窄，往往用于焚烧供能。蔗糖较之葡萄糖，价格便宜且易获得，种植户在实际生产中可以使用食用白糖代替。天麻种植户利用上述原料培养蜜环菌液体菌种，可以成本降低并获得较高质量的菌株，同时实现废物利用，减少对环境的污染危害。

[1]徐锦堂，冉砚珠.中国天麻栽培学 [M].北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1993

[2]兰进，徐锦堂，陈向东.天麻栽培技术百问百答[M].(第二版).北京:中国农业出版社,2009

[3]熊鹰，姜邻，唐利民.蜜环菌母种培养基筛选试验[J].中国食用菌.2004,23(5):25－26

[4]彭述敏，陈玉惠，程立君等.2株优良天麻共生蜜环菌生长条件筛选[J].中国食用菌.2010,29(4):22－25

[5]程显好，刘林德，董洪新等.蜜环菌菌丝体液体培养条件的优化[J].中药材.2007,30(5):509－512

[6]唐启义.DPS数据处理系统－－实验设计、统计分析及模型优化[M].北京：科学出版社，2006

[7]秦国夫， 赵俊，郭文辉.蜜环菌的生物学研究进展[J].东北大学学报.2004,32(6):89－94

[8]华秀爱.速培蜜环菌促进天麻速生高产实验 [J].中国食用菌.2003,23(1):27－29

[9]高新一.板栗栽培技术[M].(第三版)北京:金盾出版社，2009

[10]冯景刚.玉米芯生料袋栽香菇的试验 [J].中国食用菌.2004,23(2):36－44