FAT10基因单体型与肝细胞癌的相关性研究

袁荣发 余新 刘秀霞 王庆诺 蔡红平 邵江华

1.南昌大学第二附属医院肝胆外科，△江西省分子医学重点实验室，南昌 江西 330006；2.南昌大学医学院流行病学及统计学教研室，南昌 江西 33006

FAT10基因单体型与肝细胞癌的相关性研究

袁荣发1余新1刘秀霞△王庆诺1蔡红平2邵江华1△

1.南昌大学第二附属医院肝胆外科，△江西省分子医学重点实验室，南昌 江西 330006；2.南昌大学医学院流行病学及统计学教研室，南昌 江西 33006

背景与目的：人类白细胞抗原FAT10是类泛素调节子蛋白家族中的一员，被认为与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)发生、发展密切相关。本研究探讨FAT10基因单体型与肝细胞癌的关系。方法：收集254例肝癌病例和268例健康对照人群外周血标本，提取DNA，通过DNA测序分析方法，检测两组人群FAT10基因外显子和侧翼序列单核苷酸多态性。应用Haploview统计软件分析研究对象的连锁不平衡和单体型，并应用病例对照分析方法进行相关性研究。结果：在肝癌组和对照组FAT10基因外显子和侧翼序列上共检测到10个多态性位点。遗传不平衡发现-143 A/G、-121 A/G、+3446 C/T、+3476 T/C、+3527 T/C、+3607 T/C、+3620 C/G、+3803 C/G、+3809 G/T 9个SNPs在同一个单体型块，其中-121 A/G、+3476 T/C、+3607 T/C、+3620 C/G和+3809 G/T多态位点完全连锁。进一步选择-143 A/G、+3476 T/C和+3527T/C 3个tagSNPs进行关联分析和单体型构建，发现-143 A/G和+3476 T/C基因型与相应的野生型纯合子相比能明显降低肝癌发病的风险(P＜0.05)。进一步单体型分析发现ATT、ATC、GCT和ACT 4种单体型，其中肝癌患者的GCT和ACT单体型频率显著低于对照组(P＜0.05)，而ATT单体型频率显著高于对照组(P＜0.05)，经过1×108的随机置换检验校正后，ATT和GCT单体型与肝癌的发病风险仍然显著相关。结论：FAT10基因单体型可能与肝癌的发病风险相关，ATT单体型可能是肝癌的遗传标志。

肝细胞癌；单体型；病例对照研究；FAT10基因

泛素与泛素类似的小蛋白家族，被称为泛素样蛋白(ubiquitin-like proteins，UBLs)，且新成员不断增加［1］。人类白细胞抗原FAT10属于类泛素蛋白家族中的泛素样修饰蛋白UBLs，是一个分子量为18×103、包含165个氨基酸残基的蛋白质，由两个泛素样结构域融合而成。研究证实FAT10参与各种基本的细胞发展过程，包括免疫炎性介导、信号转导、蛋白易位和细胞周期调控等。另外，有研究发现，FAT10在肝癌细胞、胃癌细胞和妇科癌细胞等患者中表达上调［3］，而且我们研究也发现降低FAT10基因的表达能明显抑制Hep3B肝癌细胞生长，其主要停滞在G0/G1期，而S期和G2/M期细胞所占比例下降［4］。 这些表明FAT10在肝癌的发生发展中发挥重要作用，但其单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism, SNP)和单体型在肝癌中的分布情况及与肝癌发病风险的关联分析未见报道。

单核苷酸多态性是在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的一种DNA序列多态性，是人类基因组中最常见的遗传变异［5］。而位于一条染色体特定区域的一组相互关联、并倾向于以整体遗传给后代的SNP组合称为单体型，决定基因的功能单位和人群遗传变异的内在特征［6］。单体型的存在可以极大地减少疾病关联研究的工作量，以单个SNP为中心进行复杂性状疾病的易感基因研究常缺乏说服力，而利用相邻的SNP信息关联构成的单体型分析则越来越受到欢迎。本研究运用DNA测序的方法检测FAT10基因外显子和侧翼序列SNPs位点的分布情况，并依据遗传不平衡分析和纳入标准选择TagSNPs位点；随后进一步应用Haploview统计软件进行单体型构 建，同时采用单体型病例对照研究方法探讨FAT10基因单体型与肝细胞癌发病风险的关联。

1 材料和方法

1.1 研究对象

254例肝癌患者和268例健康对照人群均为汉族。肝癌患者外周血标本来自2007年1月—2010年12月南昌大学第二附属医院肝胆外科收治的经手术后病理确诊的病例；继发性、复发性及接受非自体输血患者除外；健康对照组为同期同地区健康体检人群。病例组和对照组在性别、年龄、吸烟及饮酒上的差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

1.2 标本采集及基因组DNA提取

经患者的知情同意后， 抽取所有研究对象静脉血5 mL置入装有枸橼酸钠抗凝剂的试管中,采集后全血立即置-20 ℃保存。采用酚-氯仿抽提法提取全血细胞DNA。经紫外分光光度计测定DNA浓度后将DNA样品置-60 ℃储存待检。

1.3 FAT10基因SNPs检测

FAT10基因各外显子和侧翼序列的多态性分析均采用DNA测序(DNA sequencing)方法，所有分型工作都是在不知道对象分组情况下进行的，同时为了保证分型工作的正确性，以10%样本量重复检测。PCR体系为16 μL，包括2×Master Mix 8.75 μL，0.5 μmol/L引物 (FAT10基因第一外显子和5’-非编码区上游：5’-TAGACATAGAGATCTGCAGC-3’，下游：5’-TTCTCCTGAAGGATGCCTGC-3’；F A T 1 0基因部分第二外显子上游：5’-TCCTAGGTAACTGTCTTGTG-3’，下游：5’-TCCATTGCAAGTCACAATC-3’；FAT10基因部分第二外显子和3’-非编码区上游：5’-CAGCTCAGTGGCACAAGT-3’，下游：5’-ACAAGGTATCAAGACAGA-3’)各1 μL，50 ng/μL DNA 模板1 μL，ddH2O 5.75 μL。采用Touchdown 程序在ABI 9700型扩增仪上进行，4 ℃保存。PCR扩增产物纯化后采用BigDye Terminator v3.1试剂盒(ABI公司，美国)进行测序分型以确定SNP位点。

1.4 tagSNP位点的选择

根据DNA测序数据和LD分析图，本研究采用贪婪算法进行系统打分来选择位点，对一个特定的单核苷酸多态性位点主要考虑了以下几个因素：①多态性位点的次要等位基因频率>5%；②Hardy-Weinberg 概率>0.001；③杂合子；④适用于基因分型平台分析；⑤选择能捕获尽量多的SNPs。

1.5 连锁不平衡和单体型分析

采用HaploView统计软件(http://www.broad.mit.edu/haploview/haploview)及以D’和r2评估FAT10基因多态性位点之间的连锁不平衡情况［7］，同时也进行单体型频率估计及关联分析，其中频率低于0.01的单体型除外。

1.6 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析。以χ2检验比较性别、组间年龄、吸烟、饮酒、各基因型等分类变量在肝癌病例组与对照组之间分布的差异，采用χ2拟合优度检验明确各变异基因型在对照组分布是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。运用非条件logistic回归分析计算单体型OR值及其95%CI，采用 Haploview 统计软件的随机置换检验程序校正实验结果，随机置换检验数值设置为10 000 000。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 研究对象的一般特征

患者组与对照组相比，两组间在性别、年龄、吸烟、饮酒人数的分布和(或)构成比上差异均无统计学意义(P>0.05，表1)。其中年龄、性别为本研究的匹配因素，两组研究对象的性别构成基本一致(P>0.05)，年龄分布均衡。

表 1 肝癌组和对照组患者一般特征分布比较Tab. 1 General information of control group and HCC group patients[n(%)]

2.2 FAT10基因SNPs检测结果

在H CC患者和正常对照人群中共检测到10个单核苷酸多态性位点，即-143 A/G(rs362535)、- 121 A/G(r s2272991)、+ 3446 C/T、+3 476 T/C(rs2076484)、+3527 T/C(rs2076485)、+3607 T/C(rs2076486)、+3620 C/G(rs2076487)、+3803 C/G(rs8337)、+3809 G/T(rs7757931)和+3833 G/C(rs444013)，其中+3446 C/T SNP为新的位点(图1)。

-143 A/G和-121 A/G位于5’非编码区。+3446 C/T、+3476 T/C、+3527 T/C、+ 3607 T/C、+3620 C/G、+3803 C/G和+3809 G/T位于第二外显子，+3833 G/C位于3’的非编码区(图2)。

2.3 FAT10基因的连锁不平衡分析

运用Ha ploview统计进行连锁不平衡分析发现-143 A/G、-121 A/G、+3446 C/T、+3476 T/C、+3527 T/C、+3607 T/C、+3620 C/G、+3803 C/G和+3809 G/T 9个SNPs处于同一单体型块中，其中-121 A/G、+3476 T/C、+3607 T/C、+3620 C/G和+3809 G/T多态位点完全连锁。

2.4 FAT10基因tagSNPs位点的选择

根据遗传不平衡分析和TagSNP的纳入标准，-143 A/G、+3476 T/C和+3527 T/C 3个多态性位点选入本研究。+3476 T/C tagSNP 能tag 其他4个SNPs(-121 A/G、+3476 T/C、+3607 T/C、+3620 C/G和+3809 G/T多态位点完全连锁)；+3446 C/T、+3803 C/G和+3833 G/C多态性位点被排除(+3446 C/T和+3803 C/G多态性位点次要等位基因频率<5%，+3833 G/C多态性位点Hardy-Weinberg平衡定理概率P<0.001，表2)。选取的3个多态性位点的基因型分布在病例组和对照组均符合Hardy-Weinberg平衡定律。

表 2 病例组和对照组FAT10基因SNPs 一般信息Tab. 2 List of the information of the detected SNPs and the minor allele frequencies of the FAT10 gene among the study subjects

2.5 FAT10 基 因TagSNPs基因型、等位基因与肝细胞癌风险的相关性

肝癌患者和健康对照组FAT10基因TagSNPs的基因型及等位基因分布频率见表3。-143 A/G和+3476 T/C多态位点能降低肝癌的发病风险(P<0.05)。

2.6 单体型分析

肝癌患者组和对照组FAT10基因的单体型分布频率见表4，结果发现ATT、ATC、GCT和ACT共4种单体型，其中肝癌患者的GCT和ACT单体型频率显著低于对照组(P<0.05)，而ATT单体型频率显著高于对照组(P<0.05)，经过1×108的随机置换检验校正后，ATT和GCT单体型与肝癌的发病风险仍然显著相关(P<0.05)。

表 3 病例组和对照组FAT10基因SNPs基因型、等位基因的分布情况Tab. 3 Frequency of FAT10 TagSNPs alleles and genotypes among patients and controls and the associations with the risk of HCC[n(%)]

表 4 病例组和对照组FAT10基因单体型分布情况Tab. 4 Frequencies of the haplotypes of the FAT10 gene in the HCC patients and controls and the associations with the risk of HCC n(%)

3 讨 论

有研究发现，在结肠良性肿瘤、癌前病变及恶性肿瘤中，FAT10基因表达逐渐增加［8］。表明FAT10可能参与结直肠肿瘤的恶变。Allon等［9］发现在FAT10基因敲除小鼠中FAT10缺陷能促进癌细胞的凋亡。FAT10的表达水平也被发现同p53突变、淋巴转移和TNM分级有关［10］。本研究的前期研究也证实，FAT10基因在肝癌细胞中发挥重要功能［4］，这些充分说明FAT1 0与肝癌等恶性肿瘤关系密切，但其具体遗传学作用机制尚不清楚。

本研究运用DNA直接测序方法检测522例(包括254例肝癌患者和268例正常对照组)中国汉族人群的FAT10基因外显子和侧翼序列的SNPs位点分布情况，同时利用Haploview软件构建肝癌患者和对照人群FAT10基因的单体型并进行关联性分析。我们发现在肝癌患者和对照人群中FAT10基因外显子和侧翼序列存在10个SNPs：143 A/G(rs362535)、-121 A/G(rs2272991)、+3446 C/T、+3476 T/C(rs2076484)、+3527 T/C(rs2076485)、+3607 T/C(rs2076486)、+3620 C/G(rs2076487)、+3803 C/G(rs8337)、+3809 G/T(rs7757931)和+3833 G/C(rs444013)，其中+3446 C/T是新的SNP。随后我们进行遗传不平衡分析发现-143 A/G、-121 A/G、+3446 C/T、+3476 T/C、+3527 T/C、+3607 T/C、+3620 C/G、+3803 C/G和+3809 G/T 9个SNPs位于同一个单体型块，其中-121 A/G、+3476 T/C、+3607 T/C、+3620 C/G和+3809 G/T

*多态位点完全连锁(D’=1)。根据LD分析和tagSNP选择标准本研究选择-143 A/G、+3476 T/C和+3527T/C 3个tagSNPs进行关联分析-143 A/G和+3476 T/C基因型与相应的野生型纯合子相比能明显降低肝癌发病的风险(P<0.05)。进一步单体型分析发现ATT、ATC、GCT和ACT共4种单体型，其中肝癌患者的GCT和ACT单体型频率显著低于对照组(P<0.05)，而ATT单体型频率显著高于对照组(P<0.05)，经过1×108的随机置换检验校正后，ATT和GCT单体型与肝癌的发病风险仍然显著相关。上述研究表明，FAT10基因该单体型遗传区域可能在调节肝癌的易感性方面起重要作用。根据Gabrial等［11］的建议：侯选基因的单体型一般应小于1 SNP/5 kb且实际间距趋于均匀方适于单体型分析。本研究构建的FAT10的单体型符合上述原则能够代表FAT10基因的功能单位，可用于FAT10基因的功能研究。

综上所述，FAT10基因单体型可能与肝癌的发病风险相关，ATT单体型可能是肝癌的遗传标志。由于本研究为小样本非随机抽样，因此应在大样本和不同种族群体中进一步研究。并且需要获得更多的研究结果来进一步阐明FAT10基因单体型产生效应的具体分子机制，这将为肝癌的疾病的诊断、个体化治疗及判断预后提供新的方法。

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Association on the haplotypes of FAT10 gene and hepatocellular carcinoma

YUAN Rong-fa, YU Xin,LIU Xiu-xia, WANG Qing-nuo, CAI Hong-ping, SHAO Jiang-hua(Department of Hepatobiliary Surgery, The Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang Jiangxi 330006, China)

SHAO Jiang-hua E-mail：shao5022@163.com

Background and purpose：The human HLA-FAT10 gene is a member of the ubiquitin-likemodifier family of proteins, are thought to be associated with the development and progression of hepatocellular carcinoma (HCC). This study aimed to assess the association between FAT10 gene haplotypes and hepatocellular carcinoma.Methods：Two hundred and sixty-eight healthy persons as control and 254 patients with HCC were recruited. Genotyping was done by using DNA sequencing. Haplotypes were determined through genotypic and disequilibrium analysis using identified single nucleotide polymorphisms (SNPs).Results：Ten SNPs in FAT10 exonic and fl anking sequence were identified, and -143 A/G, -121 A/G, +3446 C/T, +3476 T/C, +3527 T/C, +3607 T/C, +3620 C/G, +3803 C/G, +3809 G/T polymorphisms clustered in a block, the complete linkage disequilibrium(D’=1) was also detected among -121 A/G, +3476 T/C, +3607 T/C, +3620 C/G, +3809 G/T. Further more, the -143 A/G, +3476 T/C, +3527T/C SNPs were enrolled in the association analysis and haplotype analysis. The -143 A/G, +3476 T/C genotypes were associated with a decreased risk for HCC (P＜0.05). A total of 4 haplotypes were found, namely ATT, ATC, GCT, ACT, the frequency of GCT and ACT haplotypes were significantly lower for HCC patients than for control subjects(P＜0.05), and the frequency of ATT was significantly higher for HCC patients than for control subjects(P＜0.05). Ten million permutation testing also indicated that the ATT and GCT haplotypes were associated with HCC susceptibility.Conclusion：The haplotypes of FTA10 gene may be involved in the susceptibility of HCC, the ATT might serve as genetic marker for HCC.

Hepatocellular carcinoma; Haplotype; Case-control studies; FAT10 gene

10.3969/j.issn.1007-3969.2012.05.006

R735.7

A

1007-3639(2012)05-0352-06

江西省自然科学基金资助项目(No：2008GZY0059)。

邵江华 E-mail:shao5022@163.com

2011-12-16

2012-03-13）