姜黄素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞裸鼠移植瘤放射增敏的作用

王辉 牛国梁 张树友 谢荣俊 梁娜

1. 南华大学附属南华医院普外科，湖南 衡阳 421002；2. 合肥市第二人民医院普外科，安徽 合肥 230041

姜黄素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞裸鼠移植瘤放射增敏的作用

王辉1,2牛国梁1张树友1谢荣俊1梁娜1

1. 南华大学附属南华医院普外科，湖南 衡阳 421002；2. 合肥市第二人民医院普外科，安徽 合肥 230041

背景与目的：姜黄素(curcumin)能有效增强放射线对肿瘤的作用，但其作用机制尚不清楚。该研究旨在探讨姜黄素是否对人乳腺癌MDA-MB-231细胞裸鼠移植瘤有放射增敏效应，并探讨其协同抑制效应的机制。方法：人乳腺癌裸鼠移植瘤模型建立成功后，将裸鼠随机分为4组：对照组、药物组、放射组和联合组(姜黄素+放射)，每组6只；检测裸鼠移植瘤的体积及体质量，计算抑瘤率，并绘制移植瘤的生长曲线；免疫组织化学法检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达；蛋白质印迹法(Western blot)检测基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)及缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的蛋白表达。结果：联合组的抑瘤率［(71.62±6.11)%］显著高于放射组［(41.76±5.84)%］(P＜0.05)。免疫组化结果显示，单纯放射不能使VEGF表达下调(P＞0.05)，姜黄素联合放射能明显抑制VEGF的表达(P＜0.01)。Western blot结果显示，姜黄素与放射均可抑制MMP-9的表达，两者联用较单纯放射效果更加显著(P＜0.05)；单纯放射不能抑制HIF-1α的表达(P＞0.05)，姜黄素联合放射HIF-1α蛋白表达显著降低(P＜0.01)。结论：姜黄素可以增强乳腺癌裸鼠移植瘤的放射敏感性，其机制可能是通过下调VEGF、MMP-9和HIF-1α的蛋白表达而发挥作用。

姜黄素；乳腺癌；血管内皮生长因子；基质金属蛋白酶-9；缺氧诱导因子-1α

乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一，放疗正成为乳腺癌特别是早期乳腺癌治疗的重要手段，但在接受放疗时可能出现放射抗拒、肿瘤复发、不良反应增多等情况［1］。因此，寻找一种放射增敏剂是当前的研究热点。姜黄素是从姜黄中提取的一种多酚，具有高效低毒、胃肠道反应较小的特点。近来研究发现，姜黄素不仅具备抗肿瘤作用，还可以增强放射敏感性［2-4］，但其具体机制尚不清楚。为此，本实验研究姜黄素对人乳腺癌MDAMB-231细胞裸鼠移植瘤放射敏感性的影响，探讨其放射增敏的机制。

1 材料和方法

1.1 材料

人乳腺癌MDA-MB-231细胞株购自中科院上海生物研究所；BALB/c裸鼠(雌性，4~5周龄，体质量18~22 g)，购自上海斯莱克实验动物有限公司；免疫组化试剂盒及蛋白质印迹法(Western blot)试剂盒购自北京中杉金桥生物有限公司，姜黄素购自Sigma公司，用二甲基亚砜(DMSO)配成储存液，于-20 ℃下保存，使用前用无菌的0.9%NaCl溶液稀释至所需浓度。

1.2 细胞培养及裸鼠模型的制备

人乳腺癌MDA-MB-231细胞置于37 ℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中。培养液为RPMI-1640，其中含10%小牛血清和1×105U/L青霉素及链霉素。将培养的MDA-MB-231细胞配成单细胞悬液，每只裸鼠背部皮下按0.2 mL接种，每只裸鼠平均接种6×106个细胞，共24只。移植瘤长至直径为5 mm时认为接种成功，给药之前将裸鼠随机分成对照组、药物组、放射组和联合组(姜黄素+放射)共4组。

1.3 动物给药及放射线照射

待肿瘤体积为120 mm3时，对照组给予0.9%NaCl溶液0.2 mL/d灌胃，药物组给予姜黄素15 mg/(kg·d)灌胃，放射组给予一次性20 Gy射线照射，联合组给予姜黄素15 mg/(kg·d)和一次性20 Gy射线照射。照射采用10 mV的电子线，剂量率为250 cGy/min，裸鼠背部置于放射野中，其余身体部分用铅板阻隔，SSD为96 cm。照射完毕后继续饲养，连续观察30 d后断颈法处死裸鼠称取瘤重，计算抑瘤率，肿瘤体积=(长径×短径2)/2，抑瘤率=(对照组移植瘤体积-实验组移植瘤体积)/对照组移植瘤体积×100%。

1.4 免疫组织化学检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达

切片常规脱蜡水化后，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶的活性；组织抗原修复，动物血清封闭，滴加VEGF一抗，工作液浓度为1∶100(产品为北京中杉金桥生物有限公司)，4 ℃温育过夜，二抗温育后链霉素抗生物素蛋白工作液温育，DAB显色，苏木素复染，依次脱水、透明、固定。以PBS代替一抗作为对照物，在细胞核、细胞膜或细胞质中呈现棕黄色为阳性。图像分析：在20倍物镜下，随机测量100个阳性细胞的平均灰度值(背景灰度值-实测灰度值)，颜色越深，灰度值越小。

1.5 Western blot检测基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)及缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)蛋白的表达

取少量标本置于研钵中，裂解液充分裂解提取蛋白，BCA法进行蛋白定量，取40 μg蛋白SDS-PAGE凝胶电泳，将凝胶中的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，封闭震荡1 h，分别加入稀释浓度为1∶500的MMP-9及HIF-1α一抗(购自北京中杉金桥生物有限公司)，以β-actin为内参，37 ℃温育1 h，洗膜后加入再分别相应二抗，工作液浓度为1∶1 000，37 ℃温育1 h。暗室中用ECL发光法显色，曝光，定影，水洗，实验重复3次。胶片用扫描仪进行灰度扫描，Alpha Imager 2200软件分析各组标本灰度值(V值)，并将V值与对应标本的Vβ-actin相比，计算出样本蛋白相对表达量。

1.6 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，数据采用表示。4组样本均数比较采用方差分析中S-N-K法(Students-Newman-Keuls)，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 裸鼠移植瘤重量及体积变化

对照组、药物组、放射组及联合组的瘤重分别为(1.802±0.298)g、(1.378±0.267)g、(1.108±0.232)g和(0.598±0.211)g，组间差异均有统计学意义(P<0.05)。各组移植瘤的体积随时间均呈增大变化(表1、图1)，对照组的增长幅度最大，联合组增长幅度最小。以对照组为参照，药物组、放射组及联合组抑瘤率分别为(32.84±3.49)%、(41.76±5.84)%和(71.62±6.11)%，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 免疫组化检测VEGF表达情况

免疫组化结果(表2、 图2)显示，与对照组比较，单纯放射不能使VEGF表达下调(q=0.733，P=0.474)，姜黄素可以明显抑制VEGF的表达(q=4.390，P<0.01)，而姜黄素联合放射抑制VEGF表达更加显著(q=14.929，P<0.01)。

表 2 免疫组化检测各组移植瘤中VEGF蛋白表达情况Tab. 2 The expression of VEGF protein by immunohistochemistry in each group

2.2 Western blot检测MMP-9及HIF-1α蛋白的表达情况

表 1 各组移植瘤体积随时间变化情况Tab. 1 The changes of xenograft’ size with time in each group(mm3)

以β-actin为内参照，Western blot检测结果(表3、图3)显示，姜黄素与放射均能抑制MMP-9的表达，两者联用较单纯放射效果更加显著(P<0.05)。与对照组相比，单纯放射不能使HIF-1α蛋白表达下降(q=0.977，P>0.05)；而相对于药物组和放射组，姜黄素联合放射后HIF-1α蛋白表达降低(q=9.938，P<0.01；q=18.573，P<0.01)。

表 3 Western blot检测各组移植瘤中MMP-9和HIF-1α蛋白表达的半定量统计Tab. 3 The expression of MMP-9 and HIF-1α protein by Western blot in each group

3 讨 论

VEGF是已知活性最强的促血管生成因子［5］，与bFGF、内皮素-1、TGF-β等多种促血管因子诱导肿瘤毛细血管生成和血液循环的建立。研究发现，VEGF不仅参与肿瘤的发生与侵袭，而且与放射抵抗密切相关，由此影响肿瘤放射治疗的敏感性［6-7］。本实验结果显示，单纯放射不能抑制VEGF的表达，姜黄素联合放射后VEGF表达下调，提示单纯射线的电离作用诱导VEGF的高表达，降低了放射敏感性，而姜黄素通过阻断血管内皮细胞的特异活性，抑制其分裂增殖，使VEGF表达下调，从而起到了放射增敏效应及其抗癌作用［8］。

MMP-9是依赖金属锌离子蛋白水解酶成员之一，参与降解基底膜和细胞外基质等病理生理过程，并在多数肿瘤中呈高表达。本研究中，姜黄素与放射均可抑制MMP-9的表达，两者联合抑制效应大于单用姜黄素和放射之和，证实姜黄素具有增强放射线敏感性的作用，这与Kunnumakkara等［9］研究发现姜黄素联合放射明显抑制人结肠癌裸鼠移植瘤中MMP-9的表达相一致，推测其增敏的机制可能是通过减少MMP-9的表达，抑制肿瘤细胞基底膜和细胞外基质的降解，从而起到了放射增敏的效果。HIF-1是乏氧细胞调节其生长微环境的一种内源性因子，由HIF-lα和HIF-lβ两个亚单位组成。增长迅速的肿瘤细胞容易产生乏氧细胞，后者导致机体微循环障碍，影响放射线对肿瘤细胞的杀伤效果。本研究结果显示，单纯放射不能抑制HIF-1α的表达，联用姜黄素后HIF-1α表达明显下调，表明肿瘤细胞对单纯放射存在抗拒性可能与肿瘤内乏氧细胞有关，而姜黄素可能缓冲了射线产生乏氧细胞的数量，增强了放射的敏感性［10-11］。因此，通过阻断HIF-1α的途径，可能是姜黄素在乳腺癌放射增敏中的又一机制。

本研究证实了姜黄素对乳腺癌裸鼠移植瘤有放射增敏作用，MMP-9介导细胞外基质的降解与肿瘤血管生成密切相关；而HIF-1α诱导的乏氧细胞，导致肿瘤局部血供障碍，肿瘤组织中VEGF、MMP-9和HIF-1α三者彼此相互影响，严重影响了放射效果。实验中我们还发现，单纯放射可以抑制移植瘤的重量和体积，却不能抑制肿瘤内VEGF和HIF-1α的表达，其原因为肿瘤形成是一个复杂的过程，有多种因素及机制参与，同时还存在与其他信号通路的“交叉对话”。具体机制及其他信号通路需要进一步探讨和研究，期待能为乳腺癌综合治疗寻找新的方向。

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Effect of curcumin on radiosensitization on xenograft tumor of breast cancer of MDA-MB-231 cells in nude mice

WANG Hui, NIU Guo-liang, ZHANG Shu-you, XIE Rong-jun, LIANG Na(Department of General Surgery, the Affiliated Nanhua Hospital, University of South China, Hengyang Hunan 421002, China)

ZHANG Shu-you E-mail：zshuyou2@126.com

Background and purpose：Curcumin can enhance the radiation sensitivity on tumor effectively,but the mechanism of radiosensitization is still unclear. The present study aimed to investigate whether curcumin could enhance the radiation sensitivity on xenograft tumor of breast cancer of MDA-MB-231 cells in nude mice, and to investigate the underlying mechanism.Methods：Human breast cancer xenograft model on nude mice was established successfully, and the mice were divided into 4 groups: control group, curcumin group, radiation group, combination group (radiation+curcumin) (6 mice each group). The size and weight of xenograft tumor were detected, the tumor inhibition rate was calculated and the xenograft tumor growth curve was depicted. Immunohistochemistry was adopted to detect the expression of VEGF. Western blot was used to detect the expression of MMP-9 and HIF-1α.Results：The tumor inhibition rate in the combination group [(71.62±6.11)%] was significantly higher than that in the radiation group [(41.76±5.84)%](P＜0.05). The result by immunohistochemistry showed that radiation therapy could not inhibit the expression of VEGF (P=0.05), while curcumin and radiation combination inhibited the expression of VEGF(P＜0.01). The result of Western blot showed that curcumin or radiation inhibited the expression of MMP-9, curcumin and radiation combination inhibited the expression of MMP-9 more significantly (P＜0.05). Radiation could not inhibit the expression of HIF-1α (P＞0.05), curcumin and radiation combination inhibited the expression of VEGF significantly(P＜0.01).Conclusion：Curcumin can enhance the radiosensitivity in nude mice xenografts of breast cancer, and the mechanism involves the down-regulation of VEGF, MMP-9 and HIF-1α.

Curcumin; Breast cancer; VEGF; MMP-9; HIF-1α

10.3969/j.issn.1007-3969.2012.05.004

R73-36+1；R737.9

A

1007-3639(2012)05-0342-05

湖南省中医药科研计划项目(NO：2010087)。

张树友 E-mail:zshuyou2@126.com

2011-12-09

2012-03-14）