切除卵巢对大鼠学习记忆和海马雌激素受体α的影响及电针的干预作用

雌激素对中枢神经系统具有重要的保护作用，雌激素缺乏可造成认知功能障［1］。绝经后妇女用雌激素替代治疗可提高绝经后妇女的认知和记忆能力［2］。但是有报道称绝经后妇女长期使用雌激素替代治疗有提高乳腺癌和子宫癌发病率的危险［3］。在临床上，电针对治疗老年妇女认知功能障碍有一定的疗效［4］，但其作用机制尚不清楚。本实验采用卵巢切除大鼠模型，造成认知功能障碍，观察电针对去卵巢大鼠空间学习记忆及敏感脑区－海马［5］雌激素受体 α（estrogen receptor alpha，ERα）表达的影响，探讨电针改善绝经后妇女认知功能的机制，以期为临床相关疾病的治疗提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 实验动物 健康雌性SD大鼠40只，3月龄，体重160 g～200 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号：SCXK（泸）2007－0005。采用随机数字法将大鼠随机分成4组，每组10只：①电针组；②假电针组；③模型组；④假手术组。

1.2 认知功能障碍模型制备 所有大鼠均行10％水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL／100 g）。假手术组切除卵巢周围脂肪，其余各组均实行双侧卵巢切除术。①组切除卵巢2周后予电针刺激，选穴方法按华兴邦氏的方法实施，选取“足三里”“肾俞”两穴，在不麻醉的状态下采用一次性细美容针刺入穴位，双侧足三里穴接通韩氏电针仪，刺激参数：连续脉冲波，频率3 Hz～4 Hz，强度4 mA～5 mA，以使大鼠后肢抖动为宜，在上午9时开始，每次20 min，隔日 1次，连续治疗 3个月；②组针刺操作同①组，但不接通电针仪；③④组术后不予任何处理。

1.3 大鼠的学习记忆能力测试 各组在上述处理完成后进行Morris水迷宫测试。首先进行定位航行试验：历时4 d，每天上下午各2次，结果取4 d的平均值，将大鼠面向池壁，分别从4个入水点放入池中，记录大鼠寻找到并爬上平台所需时间即为逃避潜伏期时间，并记录4 d的平均游泳距离和游泳速度。定位航行试验后去除平台行空间探索试验：将大鼠任选一个入水点将大鼠放入池中，测定其在120 s内跨越平台位置的次数。

1.4 大鼠海马ERα表达水平的检测 水迷宫测试后1周将大鼠用10％水合氯醛（0.3 mL／100 g）麻醉，颈总动脉取血，分离血清，－80℃低温冰箱保存。在冰面上断头取脑，并迅速分离海马组织，立即将海马组织置液氮中，于－80℃低温冰箱保存，待用于组织蛋白和mRNA的提取。

1.4.1 大鼠血清雌二醇（estradiol，E2）浓度的检测 采用酶联免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），最后统一检测血清E2水平。空白孔加标本或标准品稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品（100 μL／孔），36℃孵箱孵育90 min。空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液（100 μL／孔），36℃孵箱孵育60 min。空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液（100 μL／孔），36℃孵箱孵育 30 min。加入显色底物 100 μL／孔，36℃孵箱孵育 15 min。加入终止液100 μL／孔，混匀后即刻测量450 nmOD值。

1.4.2 大鼠海马 ERα蛋白表达的检测 采用免疫印迹法（Western blot，WB）检测，组织充分裂解，离心，分装。配置蛋白标准液，测定并绘制标准曲线，制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶，按恒流200 mA通电，电转移100 min。加入封闭液和适量一抗抗体ERa（1∶400 Santa Cruz），摇床摇荡孵育（4℃，过夜）。PBST漂洗滤膜，将膜与HRP结合的二抗（辣根过氧化酶标记抗体）用封闭液稀释（1∶5000）室温下摇荡孵育2 h，然后用PBST充分洗膜。曝光、显影、洗像。对各特异性蛋白条带与相应的内参条带进行灰度扫描，以两者比值作为该蛋白合成的相对量。

表1 各组大鼠Morris水迷宫测试成绩比较（±s，n＝10）

表1 各组大鼠Morris水迷宫测试成绩比较（±s，n＝10）

注：1）与假电针组比较，经单因素方差分析P＜0.012）与模型组比较，经单因素方差分析P＜0.013）与假手术组比较，经单因素方差分析，P＜0.01

组别电针组假电针组模型组假手术组逃避潜伏期（s）18.02±4.791）2）33.61±5.622）3）42.95±4.053）18.08±4.28游泳距离（cm）361.25±35.871）2）693.22±42.552）3）930.15±38.613）395.75±30.26游泳速度（cm／s）20.55±3.24 19.97±2.69 19.85±3.52 21.79±3.44跨越平台数（t）8.53±0.831）2）3.64±0.882）3）2.35±0.443）8.94±0.91

1.4.3 大鼠海马ERαmRNA表达的检测 采用实时荧光定量PCR（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）检测。取100mg海马组织，用 Trizol法（Invitrogen Life Technologies）提取海马组织总RNA，紫外分析及电泳检测总RNA的纯度、浓度及完整性。逆转录按ReverTra Ace-α-逆转录试剂盒（TOYOBO）操作步骤进行。引物设计：由Invitrogen Biotechnology Co，LTD中国公司合成。ERa 上 游 引 物 ：5′-GTTTGCTCCTAACTTGCTCT TGG-3′，ERa下游引物 ：5′-CGGTGGATGTGGTCCTTCTCT-3′，扩增片段长度222 bp；内参β-actin上游引物：5′-CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3′，内参 β-actin 下游引物：5′-TA GGAGCCAGGGCA GTAATCT-3′，扩增片段长度110 bp。实时定量RTPCR反应按THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix试剂盒（TOYOBO）操作步骤进行，结果处理采用 ΔΔCT法。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0进行统计学分析，计量资料用均数加减标准差（x±s）表示，组间比较用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Morris水迷宫法行为学检测结果 与模型组比较，电针组和假电针组逃避潜伏期和游泳距离均明显缩短（F ＝64.734，P＜0.01；F ＝563.857，P＜0.01），跨越平台次数明显增加（F ＝181.451，P＜0.01），且电针组改变更为明显，与假手术组无显著性差异（P＞0.05）。各组大鼠游泳速度无显著性差异（F ＝0.122，P＞0.05）。见表 1。

2.2 电针对去卵巢大鼠血清E2，海马区ERa蛋白和mRNA表达的影响 与模型组比较，电针组和假电针组大鼠血清E2水平显著升高（F＝30.13，P＜0.01），但电针组升高更明显。电针组ERa蛋白和mRNA相对表达量均显著上升（F＝29.80，P＜0.01；F ＝96.19，P＜0.01），假电针组虽ERa蛋白和mRNA相对表达量较模型组有所上升，但仍与假手术组、电针组之间有差异（P＜0.01）。见图 1、2，表 2。

图1 各组大鼠海马ERa蛋白表达

表2 各组大鼠血清E2浓度，海马区ERa蛋白和mRNA表达比较（± s，n＝10）

表2 各组大鼠血清E2浓度，海马区ERa蛋白和mRNA表达比较（± s，n＝10）

注：1）与假手术组比较，经单因素方差分析，P＜0.012）与模型组比较，经单因素方差分析，P＜0.013）与假电针组比较，经单因素方差分析，P＜0.01

组别电针组假电针组模型组假手术组ERa mRNA相对表达量1.410±0.0621）2）3）1.153±0.0351）1.037±1.0211）2.303±0.065血清E2浓度（pg／mL）56.47±6.701）2）3）49.29±5.901）2）38.16±5.441）65.13±7.72 ERa蛋白相对表达量0.796±0.0721）2）3）0.498±0.0631）0.406±0.0401）0.985±0.086

图2 A：内参基因β-actin扩增曲线；B：内参基因β-actin溶解曲线；C：目的基因ERa扩增曲线；D：目的基因ERa溶解曲线。

3 讨论

切除卵巢是一种较好的制备雌激素缺乏模型方法［6］。去卵巢大鼠模型不仅有类似绝经妇女雌激素水平的变化，而且出现相应的学习记忆功能障碍，是一种较好的研究绝经后中枢神经系统退行性变的模型，已被广泛用于观察体内雌激素减少对机体认知功能活动影响的实验中［7］。故本实验采用去卵巢大鼠动物模型，造成认知功能障碍。陈士铎《辩证录》中立有“呆病门”，分析其主要病机在于肝郁乘脾，胃衰痰生，积于胸中，弥漫心窍，使神明受累，髓减脑消而病。因此提出本病治疗以健脾逐痰、健胃通气为主要方法。“足三里”属足阳明胃经，且为胃的下合穴，针之能健脾和胃，化痰理气。“脑为髓海”，肾藏精而生髓充脑，脑与肾关系最为密切，故选用肾的背俞穴“肾俞”补肾益髓，填精养神。

雌激素在特定脑区作用于学习或记忆，海马结构是一个对多种刺激较为敏感的区域，同时还含有丰富的雌激素受体［8］。因此本试验检测ERa蛋白和基因表达的区域定位于对学习记忆关系最为密切的脑区—海马。有报道称雌激素下降使老年大鼠海马树突棘生长降低，这种下降与海马突触部位ERa丢失相关［9］。这激发了人们的猜测：ERa是雌激素调节老年大鼠海马突触发生的基础，ERa是长期影响海马突触发生的主要受体。这些研究对在大脑发育中ERa表达的重要性提供了深远的影响，同时对海马发育中ERa表达对记忆、学习和激素调节的神经退化性疾病的影响具体重要的意义。

针刺治疗认知功能障碍的Meta分析表明：国内针刺研究大部分未设立安慰性针刺对照组进行研究，这使试验结果的客观性缺乏更有理的说服力［10］。国外对针刺治疗认知功能障碍有效性的看法不一致，有系统分析得出的结论是没有足够的证据支持针刺的有效性［11］。因此我们在试验中特别设计了假电针组作为安慰性针刺对照组，从而更为客观地研究电针对认知功能的影响。

本实验采用Morris水迷宫测试、ELISA、Western blot以及实时荧光定量PCR的方法分别检测了去卵巢大鼠行为学、血清E2浓度、ERa蛋白和基因表达的变化及电针对其的影响，结果显示：Morris水迷宫测试中，各组大鼠游泳速度没有明显差异，可以排除因个体差异引起的不同。电针组与假电针组逃避潜伏期和游泳距离较模型组缩短，穿越平台次数增加，且电针组改变更明显。徐颖［12］等研究表明电针对记忆障碍大鼠行为学有改善作用，且电针治疗后其逃避潜伏期尚优于正常对照组，本实验与上述结果一致。这说明从行为学角度评价，电针可改善去卵巢大鼠的学习记忆能力，但电针改善认知功能障碍的作用机制尚不清楚，针刺是否具有与雌激素相同的增强记忆的功能？本研究对此进行了探讨，研究结果显示，电针组大鼠体内血清E2水平明显高于模型组，说明电针能够提高去卵巢大鼠体内雌激素水平。田淑君［13］等研究表明电针足三里穴可升高去卵巢大鼠体内雌激素水平，本研究与上述研究结果一致。本实验还观察到电针组与假电针组大鼠海马ERa蛋白和mRNA表达水平与模型组相比亦明显升高，因假电针也是对穴位的刺激，故假电针组大鼠的认知功能亦有相应改善，但电针组改变更明显，排除了假电针的混杂影响。结合Morris水迷宫测试中行为学研究结果，提示电针对大鼠学习记忆的提高，可能是通过上调海马ERa蛋白和基因表达来实现的，这与王伟［14］等观察到的电针刺激足三里穴上调去卵巢大鼠海马ERa mRNA表达的结果一致。值得注意的是，本实验还采用Morris水迷宫测试研究了电针对去卵巢大鼠行为学的影响。结果提示卵巢切除后，电针足三里和肾俞穴能在蛋白和基因水平上调节ERa表达，这可能是针刺改善老年妇女认知功能障碍的机制之一。这些发现表明ERa确实参与学习记忆的过程，有助于进一步明确ERa在记忆过程中的作用。本研究也对痴呆病ERa的异常表达提供了一些证据，特别是阿尔茨海默氏病。

本研究表明，电针对大鼠脑海马ERa蛋白和基因表达均有调整作用。而电针是如何影响海马ERa的表达至今仍不明确，这可能和电针使体内雌激素的水平升高有关，也可能和电针对神经内分泌的整体调节有密切关系［15］。影响学习记忆的因素也不仅仅是ERa，值得关注的是已有研究者提出海马星形胶质细胞的过度表达可能影响痴呆大鼠的学习记忆功能［16］。因此，电针作用于海马ERa的详细机制以及对学习记忆其它相关因素的研究是我们进一步研究的目标。

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