新孢子虫荧光PCR检测方法的研究

员丽娟，史 茜，季新成，牛国辉

（1.新疆出入境检验检疫局，乌鲁木齐，830063；2. 新疆计量测试研究院，乌鲁木齐，830011）

新孢子虫病（Neosporosis）是由犬新孢子虫（Neospora caninum）寄生在宿主体内的一种原虫病，垂直传播是该病最主要的传播途径，是造成奶牛流产、产弱胎、死胎、木乃伊胎的主要原因之一，给畜牧业造成了很大的经济损失[1-2]。我国也有该病发生的报道[3]。迄今为止，还没有防治新孢子虫病的有效药物和疫苗，准确快速的检测方法对于该病的防控至关重要。

荧光PCR方法具有特异性强、灵敏度高等优点，国外已有很多应用该方法对新孢子虫病进行检测的报道[4-5]，国内尚无该方面的研究。本研究建立了检测新孢子虫病的荧光PCR方法，为该病的精确、快速检测提供了新的技术手段。

1 材料

1.1 阳性核酸和临床样品 新孢子虫阳性核酸和刚地弓形虫阳性核酸由中国农业大学刘群教授惠赠；含有牛新孢子虫NC-5基因的阳性核酸由新疆出入境检验检疫局技术中心实验室构建保存；牛传染性牛鼻气管炎、牛环形泰勒虫、牛瑟氏泰勒虫和牛伊氏锥虫等病原阳性核酸样品由新疆出入境检验检疫局技术中心实验室保存；牛抗凝全血和流产胎儿组织病料等样品采自新疆不同牛场。

1.2 主要试剂及仪器 全血基因组DNA提取试剂盒（DP1102）、DNAzol基因组DNA快速提取试剂（DP3002）为百泰克公司产品；pMD18-T载体（D101A）、凝胶纯化回收试剂盒、Taq DNA聚合酶（5 U/µL）、DL 2000 DNA分子量标准等均为宝生物工程（大连）有限公司产品；引物、探针均由宝生物工程（大连）有限公司合成。

ABI7300荧光PCR仪为ABI公司产品；常规PCR仪为Biometra公司产品；Lambda35紫外分光光度计为PE公司产品。

2 方法

2.1 引物和探针的设计 根据N.Caninum的Nc-5基因序列（登录号：X84238.1）设计扩增出138 bp的特异性引物2条（Np和Nr）和探针1条（NTpro），序列分别为：Np：5'-GTG GTT TGT GGT TAG TCA TTC G-3'，Nr：5'-GCA TAA TCT CCC CCG TCA TCA G-3'，NTpro：5'-FAM- CAC GTT GAA ATC AGC CTG CGT CAGECLIPSE -3'。

2.2 模板DNA的制备 抗凝全血按照全血基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作；流产胎儿组织先经液氮研磨，然后按照百泰克公司的DNAzol基因组提取试剂说明进行操作。

2.3 荧光PCR扩增反应条件的优化 以已知阳性核酸为模板，以Np、Nr、NTpro为引物和探针进行扩增，Mg2+浓度分别为1.0～4.0mmol/L，dNTP浓度分别为0.1～0.4mmol/L，引物浓度分别为0.2～0.8mmol/L，探针浓度分别为0.1～0.4mmol/L，Taq DNA 聚合酶分别为0.75～1.5 u，Tm为59～61 ℃，循环参数分别为40、45和50，优化一项时其他参数不变。

2.4 特异性检测 用优化后的荧光PCR方法分别对牛传染性牛鼻气管炎病毒、刚地弓形虫、牛环形泰勒虫、牛双芽巴贝斯虫、牛瑟氏泰勒虫和牛伊氏锥虫等核酸进行扩增。每次扩增反应同时设双蒸水作阴性对照和牛新孢子虫作阳性对照，以验证方法特异性。

2.5 灵敏性检测 以109～100拷贝/反应系列梯度的重组质粒为模板，用本研究建立的荧光PCR方法进行检测。荧光PCR以出现S型扩增曲线，Ct<40，且阴性对照和空白对照均没有S型扩增曲线和Ct值，作为阳性判定标准，以结果为阳性的最高稀释度作为检测灵敏度。

2.6 重复性检测 对107、105和103拷贝/反应的重组质粒进行3次重复性扩增，以验证方法的重复性。

2.8 临床样品的检测 对采自牛新孢子虫病流行区的50份全血和8份流产胎儿脑组织用本研究建立的荧光PCR方法和二温式PCR方法进行检测[6]。

3 结果

3.1 荧光PCR反应条件建立 25 µL反应体系，其中Mg2+1.5mmol/L，dNTP 各0.2mmol/L，引物各0.4mmol/L，探针0.2mmol/L，Taq酶1.25 u，模板 1 µL，扩增条件为50 ℃，2 min，1个循环；95 ℃，5 min，1个循环；95 ℃ 15 s，57 ℃ 45 s，45个循环。扩增曲线见图1。

3.2 方法的特异性检测 通过对刚地弓形虫、牛传染性牛鼻气管炎病毒、牛环形泰勒虫、牛瑟氏泰勒虫和牛伊氏锥虫等核酸样品进行扩增，检测结果均为阴性，说明该方法具有良好的特异性。

3.3 方法的灵敏度检测 经对109～100拷贝/反应系列梯度的重组质粒进行荧光PCR 扩增，可检测到101拷贝/反应的重组质粒（图2）。并绘制扩增标准曲线 （图3）。在所测的浓度范围内，标准品的浓度与对应的Ct值呈现明显的线性相关关系，其回归曲线的斜率为-3.083，截距为42.052，相关系数R2为0.997。

3.4 方法的重复性检测 分别对107、105和103拷贝/反应的重组质粒进行3次重复性扩增检测，不同试验获得的Ct值变异系数为0.50%～1.18%，表明该方法具有很好的重复性和稳定性（图4）。

3.5 对临床样品的检测 对采自牛新孢子虫病流行区的50份全血和8 份流产胎儿脑组织进行检测，本研究建立的荧光PCR方法的阳性检出率均为10.3%（其中全血5份，流产胎儿1份），二温式PCR方法的阳性检出率为7%（其中全血3份，流产胎儿1份），表明该荧光PCR具有较高的检测灵敏度。

4 讨论

PCR方法具有快速、准确且操作简便等优点，是目前对新孢子虫病进行快速检测的常用方法[7-8]。荧光PCR是在PCR基础上发展起来的新的检测技术，与普通PCR方法相比较，不需电泳，可有效减少污染的发生，并能进一步提高检测的灵敏度和特异性[4-5]。目前，国内还没有应用荧光定量PCR技术检测该病的报道。

Nc-5基因是新孢子虫基因组中最为保守的基因，且该基因仅存在于犬新孢子虫基因组中[9]。本研究以该基因为研究对象，设计特异性引物和探针，进一步增加了方法的特异性。该方法能够检测10个拷贝/反应的核酸分子，与普通PCR相比较，进一步增加了检测结果的灵敏度，该方法具有较好的可重复性，通过对临床样品的检测，具有较好的应用效果。

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