水貂绿脓杆菌（PASD03株）鞭毛蛋白的提取与分析

吴 娟，秦晓冰，单 虎

（青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109）

近年来，随着集约化养殖，由水貂绿脓杆菌（铜绿假单胞菌）（Pseudomonas aeruginosa，PA）导致的水貂出血性肺炎常表现为群体性急性暴发，水貂前期咳嗽，后期体温升高，呼吸困难，口鼻流血，死亡率逐年增高。绿脓杆菌对外界的抵抗力极强，由于临床治疗中抗菌药物的广泛使用，不合理应用，甚至滥用及畜牧业中饲料不恰当添加等，导致绿脓杆菌耐药菌株不断出现，耐药谱不断扩大，形成恶性循环，同时也加剧了抗菌药物在水貂体内的残留，严重威胁我国皮毛业的发展，并对人类的身体健康带来了潜在危害。我国养殖业中的绿脓杆菌耐药情况已是十分严重，且呈现多重耐药特性[1-2]。因此获得一种理想的疫苗来预防水貂绿脓杆菌病显得尤为重要。

细菌鞭毛（f l agella）是细菌的运动器官并与细菌的生存密切相关[3]，鞭毛具有不耐热性抗原，在细菌致病过程中，鞭毛也直接参与细菌与宿主的粘附、感染与致病等过程，是细菌最重要的致病因子，而鞭毛蛋白是其主要的组成元件[4-5]。

绿脓杆菌的致病性与其产生多种毒力因子息息相关，毒素是绿脓杆菌致病的物质基础。绿脓杆菌主要有3类毒素，即粘附因子、内毒素（LPS）、胞外产物。细菌粘附于宿主细胞表面是对机体感染致病的先决条件，对细菌侵入宿主并有效发挥毒素等的作用具有重要意义[6]。鞭毛就是一种重要的粘附因子，毒力实验表明绿脓杆菌鞭毛是动物感染过程中的一个毒力细胞器.鞭毛不仅与运动有关，更重要的是在感染与免疫以及分类鉴定等方面发挥重要的作用，特别是免疫原性具有重要的实际意义。Yancey将粗制鞭毛于100℃加热15 min，破坏其蛋白成分后再免疫动物，结果其保护力丧失，这提示鞭毛中的保护性抗原是鞭毛蛋白[7]。绿脓杆菌鞭毛蛋白不仅可以激发机体的体液免疫，还可以引起细胞免疫，具备作为优良亚单位疫苗的主要特点。

绿脓杆菌属于革兰氏阴性菌， 绿脓杆菌鞭毛为极端鞭毛呈单个或成对排列，由蛋白质构成，是重要的表面抗原，不同血清型间有相同的鞭毛蛋白免疫原，产生免疫保护作用[8]，为疾病的诊断提供了特异性抗原，水貂SD03PA株血清型为F型，鞭毛呈b型，大部分水貂均感染此类型菌株而发病。

菌鞭毛蛋白的分离已有报道，包括细菌扩大培养后，收集细菌用不同方法使其从菌体脱落，然后纯化。但分离过程中可能由于培养基带来其他蛋白，裂菌时菌体破裂释放蛋白，甚至造成需要提取的鞭毛蛋白部分变性。为提高所培养细菌的产量，同时保持其稳定的理化特性，我们对提取方法做了简单改良：采用不同的酸碱度使鞭毛蛋白从菌体脱落，并结合机械振荡法，用（NH4）2SO4盐析获得鞭毛蛋白。结果更易得到产量高、纯度高的样品，节约了成本和时间，也为下一步鉴定提供了物质基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 营养琼脂、营养肉汤购自北京陆桥技术有限责任公司；低分子量蛋白标准购自TaKaRa公司。

1.1.2 菌株 水貂绿脓杆菌（PASD03株）（由实验室从患病水貂脏器中分离纯化，鉴定并保存所提供），由标准菌株ATCC 27853 （山东省农科院提供）质控所得。

1.1.3 主要仪器 台式超高速冷冻离心机SIGMA3K30（北京博劢行仪器有限公司）；涡旋振荡器（上海沪西仪器厂）；DELTA320电子pH计（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生产）；微型垂直板电泳槽（北京市六一仪器厂）；CL-1A磁力搅拌器（上海一科仪器设备有限公司）；JEM-1200 EX型透射电镜（日本JEOL公司）。

1.2 方法

1.2.1 培养方法

1.2.1.1 将肉汤培养液中培养好的绿脓杆菌接种到琼脂表面（大培养皿每个加1 mL，小培养皿加30 µL），37 ℃培养17～30 h后，用玻璃棒刮取菌苔，适量生理盐水重悬。

1.2.1.2 将培养好的菌株接种到500 mL肉汤中，放入恒温摇床中，转速120 r/min，37 ℃孵育12～16 h。

1.2.2 酸解法提取绿脓杆菌鞭毛蛋白

将1.2.1培养好的菌株4 ℃ 6000 r/min离心30 min收集细菌，PBS洗三次，加入1 mol/L盐酸调至pH2.0，室温磁力搅拌30 min裂解细菌，4 ℃ 10000 r/min离心1 h后，去除菌体，取上清4 ℃ 20000 r/min离心1 h，去杂质，上清液用1 mol/L NaOH溶液调pH7.2，冰浴30 min，将上清置磁力搅拌器上缓缓加入饱和硫酸铵溶液，至饱和度67%，4 ℃过夜15000 r/min离心30 min，沉淀用生理盐水透析48 h后，少量分装-20 ℃冻存。

1.2.3 差速离心法提取绿脓杆菌鞭毛蛋白

将1.2.1中培养好的菌株4 ℃离心5000r/min离心30 min。PBS洗三次，菌团悬浮于PBS中，置搅拌器内搅拌30 min以裂解细菌，再于4 ℃以16000 r/min离心15 min。取上清以40000r/min离心3h，取沉淀，混悬于少量PBS中，生理盐水透析48 h，少量分装-20 ℃冻存。

1.2.4 酸解法结合机械振荡提取绿脓杆菌鞭毛蛋白

将1.2.2中用1 mol/L盐酸调至pH2.0后所得到的菌液，加入等量无菌玻璃渣于旋涡振荡器上剧裂震荡30 min，4 ℃以10000 r/min离心1 h，去除菌体和杂质，取上清液于4 ℃以40000 r/min离心1 h，上清用1 mol/LNaOH溶液调pH7.2，冰浴30 min，将上清置磁力搅拌器上缓缓加入饱和硫酸铵溶液，至饱和度67%，4 ℃过夜，15000 r/min离心30 min，沉淀用生理盐水透析48 h后，SDS-PAGE电泳实验以及电镜观察并少量分装-20℃冻存。

1.2.5 SDS-PAGE电泳实验分析鞭毛蛋白

1.2.5.1 组装模具 将已清洗干净的两块玻璃板用封条封严，组装在电泳架上，然后固定结实。

1.2.5.2 制胶[9-10]

配制10 mL 12%分离胶：水3.3 mL，30%丙烯酰胺—双丙烯酰胺4.0 mL，1.5 mol/L Tris（pH8.8） 2.5 mL，10%（W/V）SDS 0.1 mL，10%W/V）过硫酸铵0.1 mL，TEMED 0.004 mL.

配制2 mL 5%浓缩胶：水1.4 mL，30%丙烯酰胺—双丙烯酰胺0.33 mL，1mol/L Tris（pH 6.8）0.25 mL，10%（W/V）SDS 0.02 mL，l0%（W/V）过硫酸铵0.02 mL，TEMED 0.002 mL。

1.2.5.3 点样

将蛋白样品与2×SDS凝胶加样缓冲液按1：1混和，沸水中加热 5 min上样，每孔加样20 µL。

1.2.5.4 电泳

连接好电源正负极导线，80 V恒压电泳至溴酚兰进入分离胶后，120 V电泳直至指示剂迁移至接近胶底1 cm时停止电泳。

1.2.5.5 染色与脱色

用考马斯亮蓝R-250染色，置室温摇床摇3～4 h，再将凝胶放入脱色摇床中脱色6～10 h，期间更换脱色液2～3次，观察蛋白电泳情况。

1.2.6 鞭毛蛋白镜检

电镜负染试验，采用漂浮法[11]。将提纯鞭毛蛋白样品滴于干净载玻片上，再将覆有Formvar铜网漂浮于样品滴上沾取样品3 min，用镊子取出后，37 ℃放置干燥15 min，再将铜网漂浮于pH7.0 磷钨酸液滴染色5 min，用滤纸吸去多余的染液，晾干后，使用电镜JEM-1200观察结果。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法结果比较

3种方法提取的鞭毛蛋白各20 µL进行SDSPAGE，结果见图1。

由图1可知，酸解法结合机械振荡法提取的绿脓杆菌鞭毛蛋白经SDS-PAGE 电泳结果显示只有一条清晰的蛋白条带，且蛋白分子量为53 kD，经紫外分光光度计测得其蛋白浓度为1.0 mg/mL；酸解法提取的绿脓杆菌鞭毛蛋白，为0.53 mg/mL；差速离心法提取的绿脓杆菌鞭毛蛋白，为0.15 mg/mL。

并经Quantity one软件分析可得，酸解法结合机械振荡法提取得到的绿脓杆菌鞭毛蛋白占有率为86.9%（图1，泳道2），酸解法提取的绿脓杆菌鞭毛蛋白占有率为50.1%（图1，泳道1），差速离心得到的绿脓杆菌鞭毛蛋白占有率仅为14.6%（图1，泳道3）。

因此与后两种方法相比，酸解法结合机械振荡法提取得到的鞭毛样品中有杂带出现，说明经此方法获得的鞭毛蛋白样品中含有杂蛋白。

2.2 鞭毛蛋白的镜检结果

经酸解法结合机械振荡法得到的鞭毛蛋白样品做透射电镜观察，结果如图2所示。

透射电镜观察发现，该蛋白呈经典的丝状，与其他学者报道的鞭毛蛋白形态相同，说明该蛋白就是鞭毛蛋白，且图中并没有明显的菌体和其他杂质的存在，由此可以说明经酸解法结合机械振荡法得到的鞭毛蛋白是可行的。

3 讨论

绿脓杆菌鞭毛为极端鞭毛呈单个或成对排列，其鞭毛具有很重要的理化特性，它的免疫原性在生物学和致病机制研究中具有重要的意义[12]。在提取鞭毛蛋白时，需要考虑以下两个方面的问题：一是培养绿脓杆菌时鞭毛存在的最佳培养条件，二是绿脓杆菌鞭毛的脱落方法。

实验中培养菌时首先采用固体培养基，但后来发现有学者认为液体培养基较固体培养基更能刺激细菌高度增殖和鞭毛蛋白高产，单位质量的细菌可提取更高产量的鞭毛蛋白，所以后来在培养菌时多采用液体培养基，且放入恒温摇床中，转速120 r/min，37 ℃孵育12～16 h。实验结果表明这时段的鞭毛形态正常，并且用这种方式处理获取的鞭毛蛋白纯度较高。

1988年，Peel就利用菌体细胞与小玻璃珠产生切力作用使菌体与其鞭毛得到分离，即通过机械手段来完成鞭毛蛋白的提取[13]。Ibrahim等[14]运用酸解法获得高纯度的鞭毛蛋白。也有些研究者为追求鞭毛蛋白的产量，使用富含各种蛋白的培养基，于是给纯化带来麻烦，特别当培养基有和鞭毛蛋白分子量接近的蛋白质时，很难使营养蛋白完全分离，很难获得纯化的蛋白，酸裂解法各方面的条件也很难控制[15]。本试验对文献中提取鞭毛蛋白的方法做了简单改良，采用不同的酸碱度使鞭毛蛋白从菌体脱落，并结合机械振荡法，用（NH4）2SO4盐析获得鞭毛蛋白，使提取的粗制蛋白相对较纯，后面纯化过程相对容易，从而得到高产量、高纯度的蛋白。

通过SDS-PAGE电泳实验结果可以观察到，目的条指示的分子量为53 kD，另外，通过在透射电镜下观察到的鞭毛蛋白以及SDS-PAGE实验结果，可以得出利用酸解法结合机械振荡法提取的绿脓杆菌鞭毛蛋白是具有现实价值的。

但是，用这种方法提取的鞭毛蛋白还不是很纯，总体获得率不是很高。因此，还需要进一步的探索，找到更好的方法获得大量绿脓杆菌鞭毛蛋白。

绿脓杆菌鞭毛蛋白具有良好的免疫特异性，而且研究表明提取的鞭毛蛋白要比基因克隆表达的免疫特异性好很多[8]，因此具有十分重要的研究意义，对进一步研究这种鞭毛蛋白在动物中的抗原性，制备免疫血清，并分离提纯抗原性强的鞭毛蛋白用以构建抗病亚单位疫苗，真正为防治绿脓杆菌病提供切实可用的依据，为建立水貂养殖病害预防控制与健康养殖模式，有很强的实际应用前景。

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