检测动物产品中水貂阿留申病毒和犬细小病毒复合PCR方法的建立和应用

杜雄伟，李 叶，胡传伟

（1.大连民族学院生命科学学院，大连 16600；2.辽宁出入境检验检疫局，大连 116001）

近几年随着国内外市场对裘皮需求的增长以及国外相关行业向国内的转移，国内水貂、狐狸、狍子等毛皮动物的养殖业发展极为迅速，据报道，目前我国水貂的饲养量达到800万头，从国外引进水貂良种的贸易也越来越频繁。由于经济动物养殖的高度集约化、规模化与小规模散养以及作伴侣动物并存特点。水貂阿留申病（AD）和犬细小病毒病（CP）是危害皮毛经济动物的两种重要疫病。传染性疾病的暴发流行，造成很大的经济损失；同时这几种经济动物传染病也是犬、猫和水貂、狐狸、狍子等多种经济动物进出境时的主要检疫对象，开展这些传染病病原的快速诊断方法的研究，对经济动物疫情的快速诊断与控制、加强经济动物及其产品进出境的检验检疫工作，御疫情于国门之外有重要的意义[1-2]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 水貂阿留申病毒（ADV）、犬细小病毒（CPV）本实验室自行保存。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计

通过DNAStar5.0软件对基因库中ADV、CPV的保守区域序列进行分析，应用Primer premier5.0软件设计特异性引物，均由宝生物（大连）有限公司合成，序列如下：

ADV s 5' AAGCCATTACTGGAGGTGGTGAT 3'；ADV x 5' CATGCCGAGGTCTCTTGTGC 3' 预计扩增产物536 bp。

CPVs： 5' ATTGGGCTTACCGCCATTTC 3’；CPVx： 5' TATCTTCCCGTATCTTGATGTGCT 3’预计扩增产物375 bp。

1.2.2 病毒RNA/DNA的提取

照宝生物MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.2.0试剂盒说明书进行。

1.2.3 复合PCR检测方法的扩增

取上述抽提病毒DNA液10 µL加入10×PCRbuffer 2.5 µL，各对引物分别0.5 µL，DNA Taq酶0.5 µL，dNTP（2.5mm）1.0 µL，水9 µL。94 ℃ 3 min，一个循环；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；12 ℃保存。

由于驾驶舱发生破孔瞬间，从孔口流出的气体速度非常快，过程进行的时间很短，可以将气流从孔口流出视为一维等熵流动，其伯努利方程为：

1.2.4 PCR反应条件的优化

1.2.4.1 MgC12浓度的调整 采用5个浓度梯度对MgC12浓度进行调整，即1 µmol／L、2 µmol／L、3 µmol／L、4 µmol／L、5 µmol／L。

1.2.4.2 退火温度的调整 根据设计的引物，运用公式T一2（A4-T）4-4（G4-C）计算退火温度 ，再按照实际情况，确定PCR反应中的限温度为58 ℃，然后进行一个梯度PCR反应（梯度为55 ℃、56 ℃、57 ℃、58 ℃、59 ℃、60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、65 ℃）。

1.2.4.3 Taq酶、循环次数、变性温度、变性时间、延伸温度、延伸时间等诸项进行调整。

1.2.5 扩增的特异性试验

分别用上述引物对对水貂阿留申病毒、犬细小病毒、犬肝炎病毒、犬冠状病毒分离株做PCR进行特异性试验。

1.2.6 PCR扩增的敏感性试验

以10倍系列稀释法对CDV、CPV、ADV提取的RNA/DNA液进行稀释，分别作为PCR模板，用上述试验确定的最佳PCR反应条件进行多重PCR扩增，取5 µL PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，检测该方法的敏感性。

2 结果

2.1 复合PCR检测方法的建立

复合PCR扩增（图1）结果，有明显目的条带的出现，即ADV为536 bp，CPV为375 bp。后经测序证实该序列为目的序列，表明该方法可同时区分这两种病毒。

2.2 反应条件的优化

MgC12在3 µmol／L或4 µmol／L时有特异性条带产生。当退火温度低于56 ℃时，有非特异性条带产生，当高于65 ℃时无条带产生，在55 ℃时条带最亮。只要遵循PCR反应基本条件，其他因素对PCR反应的敏感性和特异性影响不大。

2.3 特异性和敏感性

各对引物均能扩增出对应目的条带，没有产生杂带，表明该引物比较特异。用紫外分光光度计测得提取的CPV和ADV的DNA的浓度为86 ng/µL和95 ng/µL。将模板DNA作10倍系列稀释，取不同稀释度的模板DNA各5 µL分别进行PCR扩增，结果105稀释的模板仍能扩增出目的条带，106稀释的模板仅能扩增出375 bp的单带，不能扩增出536 bp条带，表明复合PCR扩增检测到4.3 Pg的ADV模板DNA及0.475 Pg的CPV模板DNA。

3 讨论

水貂阿留申病（Aleutian disease of mink，AD）是由水貂阿留申病毒（ADV）感染水貂引起的以终生毒血症、全身淋巴细胞增殖、血清γ-球蛋白增多、肾小球肾炎、动脉血管炎和肝炎为特征的一种慢性病毒病。本病在世界各养貂国家均有发生，所有品系的水貂均能感染，具有阿留申基因型的水貂死亡率可达30%。本病还能使母貂空怀率和仔貂死亡率显著升高，公貂的交配能力下降，还能影响发育而使毛皮品质低下，造成经济损失，是世界上公认的养貂的重大疫病之一[3-7]。犬细小病毒感染是1978年由美国首先发现，我国也有发生。本病只见于犬科动物，幼犬特别易感，引起肠炎和心肌炎，发病率20%～100%，致死率10%～50%，4 周龄以内死亡率最高[9-14]。

在建立复合PCR的检测方法时，引物设计至关重要，引物长度、G+C含量、Tm值应尽量一致，且各扩增片段大小要适宜，既要避免电泳不能分辨，又不能相差过大。本研究设计的3对引物GC含量相近，Tm值相近，这就保证了在相同的退火温度下，CDV、CPV和ADV都能得到很好扩增。其扩增片段分别为375 bp、536 bp，这使得在检测时能在同一个电泳胶上进行鉴定，为复合PCR方法的成功建立奠定了基础[15-17]。

CPV传统上主要依靠病毒的分离鉴定，而ADV主要通过免疫电泳进行鉴定，这些方法费时费力。而PCR技术具有简便、快速、灵敏度高等优点。本研究建立的PCR方法显示，无论是单一PCR还是多重PCR，均能扩增出CPV和 ADV特异性条带，其最小检测浓度为0.5 ng，且对犬肝炎病毒、犬冠状病毒分离株均不起反应，表明建立的方法具有很强的特异性和高度的敏感性。我们用建立的方法对CPV和ADV的混合样品进行检测，结果与预期相符，能够特异性的检测到这2种病毒，表明建立的方法可以用于CPV和 ADV的诊断和流行病学调查。

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