色甘酸钠对缺血再灌注兔心室肌电生理特性的影响

李海涛

色甘酸钠由于其具备稳定肥大细胞胞膜的药物特性而被广泛应用于变态反应性疾病的治疗中。与经典的RAS系统不同，肥大细胞所产生的AngⅡ主要作用于周边局部受体，其主要分布在心脏、大脑及眼球等器官。近期研究表明由于药理特性其可能使其具有潜在的抗缺血再灌注心律失常作用。近年来研究表明肥大细胞可以在多种因素刺激下合成及分泌肾素并依赖自身内源性蛋白酶将其转化为血管紧张素［1］。存在于心脏间质中的肥大细胞由于解剖上邻近神经细胞及心肌细胞使其易于通过各种方式将所生成的化学产物作用于相邻细胞，从而引起相应细胞功能与结构上的改变［2］。目前对该药的研究热点集中在其抑制慢性心力衰竭、高血压及心肌病的长期效应如血管内皮细胞凋亡及心内膜纤维化领域。Mackins等通过离体实验研究发现肥大细胞稳定剂能够有效抑制缺血再灌注心律失常的发生，其机制可能与抑制局部血管紧张素的生成有关［3］。但目前对于这种抗心律失常效应是否具有电生理学上的改变尚无明确的结论。

材料与方法

1.实验动物及分组:选取成年新西兰大耳白兔40只，雌雄不拘，体重约在2～3kg之间，由武汉大学人民医院实验动物中心提供。动物随机分入对照组及3种不同浓度药物处理组。

2.动物模型的制备:以30mg/kg戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉及1000IU肝素抗凝20min后，迅速取出心脏置于100%氧饱和的0℃无钙台式液中并迅速将自制管径与主动脉相近的灌流管与Langendorff灌流系统和主动脉三者依次相连并切取带有该段主动脉的左心室前壁楔形肌块，充分暴露其内膜及外膜层，结扎其他主要渗漏血管后将标本固定于灌流槽内在36.0±0.5℃恒温下恒速主动脉逆行灌流。

3.灌流步骤:对照组给予标准台式液，不同处理组给予分别含不同浓度色甘酸钠的标准台式液灌流;其后所有样本均贯序给予模拟缺血液和标准台式液灌流以模拟缺血再灌注过程。

4.溶液配制:标准台式液成分:129mmol/L NaCl，4mmol/L KCl，0.9mmol/L NaH2PO4，20mmol/L NaHCO3，1.8mmol/L CaCl2，0.5mmol/L MgSO4和 5.5mmol/L 葡萄糖;pH 7.35，充以95%的O2和5%的CO2。模拟缺血液成分:123mmol/L NaCl，12mmol/L KCl，1.2mmol/L NaH2PO4，6.0mmol/L NaH-CO3，1.8mmol/L CaCl2，0.6mmol/L MgCl2和20mmol/L 乳酸钠;pH 6.8，充以95%的N2和5%的CO2。药物处理组灌流液为标准台式液基础上分别加入10、50、100μmol/L色甘酸钠。

5.电生理指标测定:将拉制的尖端为 0.5μm，内充3.0mmol/L KCl，阻抗为15～20MΩ玻璃微电极接触并插入左心室楔形肌块心内膜及心外膜记录，经刺激仪发放波宽为2ms，输出电压为阈电压两倍强度的方波脉冲，由微电极引出细胞内动作电位。将Ag/AgCl电极分别置于心肌块两侧约1cm处记录模拟心电图。所有实验均在标准台式液灌流稳定1h后进行。(1)刺激方式:程序电刺激分为S1S2刺激与快频率S1S1刺激两种形式:①S1S2刺激设置为S1∶S2=8∶1，S1S1间期定为1000ms，S1S2间期从200ms，步长为10ms行负扫直至达到不应期;②快频率S1S1刺激设置为300ms起至200ms频段以10ms步长递减，200ms直至100ms频段以5ms连续发放刺激30s，每次切换刺激频率间隔5s，连续刺激直至达到如下任何一种电生理现象出现为止:①达到不应期或刺激呈2∶1激动心室肌:②出现室性心动过速、心室扑动或心室颤动;③出现动作电位电交替。(2)观察指标:①MAP复极90%的时程(MAPD90):MAP0期至复极达90%的时间;②APD动态恢复曲线最大斜率:APD动态恢复曲线用Origin 7.0软件拟合，所用函数为:APD90=y0+A1(1-exp-DI/τ1)。

其中A1为自由拟合变量，每一组A1与τ1对应于一个DI(舒张间期)值，最大斜率(Slopemax)由下列函数求得，函数公式为:Slopemax=(A/τ1)×［Exp(-DI/τ1)］

每个MAPD90值由连续测定的20个APD90求平均值得出，APD恢复性质实验中的APD与DI由每个刺激频段的最后5个APD与DI值求平均值得出。

5.统计学方法:采用Aknowledge 3.72软件采集与测量APD数据，应用Origin 7.0软件拟和动态恢复曲线并求出最大斜率。计量数据用均数±标准差(±s)表示，用 SPSS 13.0软件进行统计学分析，多组间均数比较采用ANOVA检验，两组间比较采用t检验;计数资料用百分比表示，用χ2检验和精确概率法统计以P＜0.05为差异有显著性。

结 果

1.室性心律失常诱发率:与对照组相比，在灌注时相各药物处理组的室性心律失常诱发率显著低于对照组(P＜0.05)(表1)。

表1 不同状态下各组VT与VF诱发率(%，n=10)

2.动态恢复曲线最大斜率的比较:在基础状态、药物灌注期及缺血时相各药物处理组的恢复曲线斜率与对照组相比无显著差异;再灌注时相，对照组恢复曲线斜率均＞1，各药物处理组恢复缺陷斜率均＜1，二者之间的差异具有显著性(P均＜0.05)(表2)。

表2 不同状态下各组动态恢复曲线最大斜率的比较(± s，n=10)

与对照组相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 基础状态 药物灌注 缺血状态 再灌注状态对照组Endo 1.01±0.26 1.03±0.35 0.85±0.24 1.39±0.52 Epi 0.85±0.28 0.82±0.36 0.92±0.21 1.20±0.27 10μm 组Endo 0.98±0.47 1.01±0.58 0.95±0.28 0.93±0.53＊＊Epi 0.70±0.36 0.72±0.59 0.80±0.35 0.72±0.10＊＊50μm 组Endo 0.86±0.54 0.97±0.68 0.98±0.26 0.46±0.28＊＊Epi 0.78±0.52 0.62±0.46 0.86±0.21 0.99±0.30*100μm 组Endo 0.94±0.45 0.93±0.73 0.89±0.25 0.98±0.39*Epi 0.83±0.45 0.84±0.46 0.90±0.21 0.84±0.55*

讨 论

实验结果显示通过抑制肥大细胞源性AngⅡ对细胞游离钙的调控作用从而影响心肌细胞的APD和恢复性质可能是色甘酸钠抑制缺血再灌注心律失常的机制之一。肥大细胞作为独立于ACE系统之外的AngⅡ供源，由于分布特点其局部效应远高于经典ACE系统。Urata等发现心脏内80%到90%的AngⅡ来源于这一途径［3］。长期高血浓度的AngⅡ可以促进多种心律失常基质的形成如心脏间质胶增生所致内膜纤维化，还可以引起室壁张力增加从而引起APD的缩短，ERP离散度增加和EAD发生。缺血状态下，交感神经末端释放的神经肽Y和去甲肾上腺素可以激活肥大细胞使其分泌肾素并转化为AngⅡ，局部高浓度AngⅡ可以通过旁分泌的方式直接作用于周围的神经细胞胞膜AT1受体引起儿茶酚胺，内皮素的合成及促进去甲肾上腺素从突触前神经末梢释放入血，并进一步介导AngⅡ生成。该过程表现为正反馈效应［4～6］。此外，AT1受体广泛分布于心脏传导系统，激活后可以产生如调节细胞内钙操控、激活钠氢交换体和PKC等一系列可以促进自发性电活动如EAD、DAD发生并增加传导速度等［7］。

近年来多项研究均提出心脏兴奋恢复性质与室性心律失常的发生具有一定的相关性，而心脏动态恢复曲线在一定程度上可以代表室性心律失常发生过程中螺旋波折返性激动的稳定性和破碎波发生的趋势。本研究中发现色甘酸钠可以平复再灌注时相APD动态恢复曲线的斜率，但是对缺血时相的斜率却无显著影响。推测色甘酸钠的这种作用可能与其抑制肥大细胞源性AngⅡ生成的直接效应或介导神经细胞胞膜钠氢交换体释放的神经递质对心肌细胞内钙离子的特殊操控有关，而在缺血状态下，心肌细胞受缺血环境下低能量供给影响，细胞内游离钙下降从而导致其兴奋性下降，故色甘酸钠对缺血状态下心脏恢复性质的影响较小，而在再灌注时相，由于钙超载使细胞内钙离子操控紊乱，该药物作用才得以体现。而AngⅡ可以通过IP3途径调节星状神经节交感神经元细胞内钙离子的水平，该效应使其具备在病理状态下引起心律失常发生的基质［8］。

1 Urata H，Kinoshita A，Misono KS，et al.Identification of a highly specific chymase as the major angiotensin II forming enzyme in the human heart［J］.J Biol Chem，1990，265(36):22348-22357

2 Silver RB，Reid AC，Mackins CJ，et al.Mast cells:a unique source of renin［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(37):13607-13612

3 Mackins CJ，Kano S，Seyedi N，et al.Cardiac mast cell-derived renin promotes local angiotensin formation，norepinephrine release，and arrhythmias in ischemia/reperfusion［J］.J Clin Invest，2006，116(4):1063-1070

4 Malik KU，Nasjletti A.Facilitation of adrenergic transmission by locally generated angiotensin II in rat mesenteric arteries［J］.Circ Res，1976，38(1):26-30

5 Imai T，Hirata Y，Emori T，et al.Induction of endothelin-1 gene by angiotensin and vasopressin in endothelial cells ［J］.Hypertension，1992，19:(6 Pt 2)753-757

6 Chua BH，Chua CC，Diglio CA，et al.Regulation of endothelin-1 mRNA by angiotensin II in rat heart endothelial cells［J］.Biochim Biophys Acta，1993，1178(2):201-206

7 De Mello WC.Renin-angiotensin system and cell communication in the failing heart［J］.Hypertension，1996，27(6):1267-1272

8 Stanley F，Fernandez，Huang MH，et al.Modulation of angiotensin II responses in sympathetic neurons by cytosolic calcium［J］.Hypertension，2003，41(1):56-63