卫星搭载对羊草种子萌发及细胞学效应的研究

潘多锋，张月学，申忠宝，王建丽，张瑞博，李道明，高 超，邸桂俐，刘录祥，钟 鹏

（1.黑龙江省农业科学院 草业研究所，黑龙江 哈尔滨 150086；2.中国农业科学院作物科学研究所/国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程，北京 100081；3.黑龙江省农业科学院大豆研究所，黑龙江 哈尔滨 150086）

太空诱变育种是利用各类飞行器（卫星、飞船或航天飞机）将农作物种子及其他生物体样品带上外太空［1］，在空间特殊环境（宇宙射线、高真空、微重力等）作用下产生变异，获得生物新品种的育种新技术［2，3］，被广泛应用于植物育种［4－8］。近年来，许多研究者将这一新的育种方法应用于牧草研究。经卫星搭载的红豆草（Onobrychis viciaefolia）、苜蓿（Medicago sativa、早熟禾（Poa pratensi）、冰草（Agropyron cristatum）、新麦草（Psathyrostachys juncea）等牧草品种，经试验发现有花期和生长期延长、抗病性增强、抗盐性和抗旱性提高、早熟、植株矮化、叶片数增加等丰富的突变类型［9－14］，为优质、高产和多抗牧草新品种的选育提供了丰富的遗传材料。

羊草（Leymus Chinensis）又称碱草，为多年生根茎型牧草，被誉为“禾本科牧草之王”，是现代牧草产业技术体系重点发展的牧草之一。羊草在自然界中以无性繁殖为主，有性繁殖为辅，其本身固有的“三低”问题（成穗率低、结实率低、发芽率低），严重制约了羊草种质资源的创新。因此，羊草新种质资源的开发与利用已成为目前研究的热点问题。我国选育出的羊草新品种很少，大多采用野生驯化选育，“三低”问题仍然存在［15，16］。目前，空间诱变技术在羊草育种中的应用研究很少有相关报道。“实践八号”卫星搭载羊草种子后对其萌发、细胞有丝分裂指数、根尖细胞核畸变及染色体畸变等进行了研究，探讨卫星搭载后羊草种子的萌发特性及细胞生物学效应，为我国羊草空间诱变育种研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

“实践八号”卫星搭载的羊草为野生东北羊草，种子由黑龙江省农业科学院草业研究所提供。

1.2 搭载处理

“实践八号”卫星是我国第1颗专用育种卫星，2006年9月9日5：00在酒泉卫星发射中心由长征二号丙运载火箭发射升空。卫星运行的近地点高度为187km，远地点高度463km，轨道倾角63°，在轨运行15d，返回舱于9月24日10：43在四川遂宁成功返回。卫星运行期间回收舱内温度在7.21～20.72℃。

将羊草干种子3 000粒用白色棉布袋包装注明，搭载于“实践八号”卫星，为太空诱变（SP），相同数量的同批种子作为对照（ck）。

1.3 发芽试验

发芽试验采用滤纸培养皿发芽法，将处理和对照种子放在铺有单层滤纸9cm玻璃培养皿内，3次重复，每重复50粒饱满种子。发芽温度16℃/28℃，12 h黑暗/12h光照。从第1粒种子萌发开始，每天观察、统计1次发芽数直至萌发结束。初计数时间为第6d，末次计数时间为20d。试验结束时在每个重复中随机取10个幼苗，用游标卡尺测量幼苗长度。

（1）发芽率＝发芽种子数/种子总数×100%

（2）发芽指数GI＝∑（Gi/Di）

式中：Gi为第i天的发芽率，Di为天数。

（3）活力指数DI＝GI×Ss式中：Ss为幼苗长度［17］。

1.4 细胞学观察

1.4.1 根尖染色体制片 将对照与搭载后的干种子50粒消毒清洗后分别放入培养皿中，置于25℃温箱中培养至露白，4℃低温处理48h，然后置25℃下继续培养，根尖长至1.5cm剪下吸干，放在冰水混合物中冷处理20～22h，用卡诺氏固定液（无水乙醇∶冰醋酸＝3∶1）固定22h。将材料从固定液中取出，用温水把根尖水洗2～3次；用预热1mol/L盐酸在60℃水浴下解离6min；取出后再用温水冲洗2～3次，并用滤纸吸干，加入谢夫试剂染色3h，然后将根尖放入醋酸洋红中复染48h，进行染色体制片（对照和搭载处理各15张）。染色体观察、取材时间非常关键，应标明根尖的具体取材时间（根尖的具体取材时间为根尖长至1.0～1.5cm时取材，减数分裂和具体时间有关，未作减数分裂方面的试验）。

1.4.2 镜检 随机抽取14个染色体制片进行细胞学统计，在20倍镜下观察，每个染色体制片更换4～5个视野，每张染色体制片统计280个细胞，Leica 4000 MB高倍显微镜下拍照。观察、统计细胞总数、分裂细胞数、正常分裂细胞数、微核数、染色体断片数、染色体粘连数、游离染色体数、染色体桥数、落后染色体数以及染色体的其他畸变数目，统计并计算：

（1）细胞分裂指数（%）＝（分裂细胞数/观察细胞总数）×100

（2）染色体畸变率（%）＝（染色体总畸变数/观察细胞总数）×100

（3）核畸变率（%）＝（核总畸变数/观察细胞总数）×100

2 结果与分析

2.1 太空诱变对羊草种子萌发的影响

太空诱变处理羊草种子的发芽率21.44%，对照为26.50%；处理发芽指数为23.10，对照为25.06；处理的种子活力指数是118.99，对照为130.19。方差分析结果和对照间的发芽率、发芽指数和活力指数处理均无差异（P＞0.05）。结果表明太空诱变对羊草种子萌发的影响不大（表1）。

表1 太空诱变下羊草种子的萌发Table 1 Effect of seed germination of Leymus chinensis on embarked by space flight

2.2 太空诱变下羊草根尖细胞有丝分裂和核畸变

太空诱变处理对羊草种子根尖细胞有丝分裂产生一定的影响（表2）。太空诱变根尖细胞有丝分裂指数为8.97%，对照为7.19%，太空诱变处理比对照增加24.17%，说明太空诱变可以促进羊草种子根尖细胞有丝分裂。

表2 太空诱变对羊草根尖细胞有丝分裂指数及核畸变的影响Table 2 Effect of the mitotic index and nuclear aberrations of root tip cells of Leymus chinensis on embarked by space flight

与对照相比，太空诱变后羊草根尖细胞在有丝分裂间期发生核畸变。太空诱变根尖细胞在有丝分裂间期出现了单微核和双微核2种类型核畸变，核总畸变率为1.57%（表2）。其中，单微核率为0.93%，是主要的变异类型，占核总畸变的59.24%，双微核畸变率为0.64%，占核总畸变的40.76%。

2.3 太空诱变对羊草根尖染色体畸变的影响

对照根尖染色体无畸变发生，太空诱变后则产生变异。太空诱变后羊草根尖细胞染色体在分裂中期出现染色体断片、染色体粘连等畸变类型；在分裂末期出现染色体单桥、双桥、落后染色体、游离染色体等畸变类型，染色体总畸变率为3.68%。其中，染色体断片所占比例最大，占总畸变类型的32.34%，其次为染色体粘连（21.78%）和染色体单桥（16.85%），染色体双桥变异最少，占总变异的9.24%（表3，图1）。

表3 太空诱变对羊草根尖细胞染色体畸变的效应Table 3 Chromosome aberrations of root tip cells in Leymus chinensis embarked by space flight

图1 “实践八号”卫星搭载后羊草根尖染色体的畸变类型Fig.1 Chromosome aberrations of Leymus chinensis embarked by space flight

3 讨论和结论

3.1 太空诱变对羊草种子萌发的影响

许云远等［18，19］的研究表明，太空诱变对草地早熟禾、红豆草、冰草和苜蓿等牧草种子的发芽率无显著影响或影响不明显，杜周和等［12］发现卫星搭载后高丹草种子发芽率和发芽势均受到不良影响，发芽能力降低。本试验结果显示，太空诱变处理对羊草种子萌发特性影响不大，虽然种子的发芽率、发芽指数和活力指数均低于对照，但差异不显著（P＞0.05）。羊草的休眠类型属萌发抑制物引起的生理性休眠，抑制物主要是脱落酸（ABA），主要抑制部位为胚乳，羊草种子的休眠是萌发抑制物与萌发促进物（多种激素，如玉米素、赤霉素、生长素等）综合作用的结果［20］。太空诱变后造成羊草种子萌发能力降低的原因有待于进一步的研究。

3.2 太空诱变对羊草细胞有丝分裂的影响

太空诱变是空间辐射、微重力和高真空等因素综合作用的结果，在诱因上与地面单一的理化诱变因素完全不同，是一个很复杂的过程。已有的研究表明，卫星搭载对当代种子根尖细胞有丝分裂有促进（分裂指数增加）和抑制（分裂指数减少）2种影响，具体效应因品种而异［21，22］。试验中太空诱变明显促进了根尖细胞的有丝分裂活动，有丝分裂指数高于对照。细胞分裂指数体现了细胞分裂能力，该能力是否会影响幼苗及后期生长需进一步研究。

3.3 太空诱变对羊草细胞核及染色体畸变的影响

细胞微核是由染色体受损后形成的断片或纺锤体受损丢失的整条染色体形成，具有可遗传性，是衡量染色体诱变损伤的可靠指标［23］。研究表明，经太空诱变后羊草根尖细胞出现了微核和双微核2种核畸变类型，说明卫星搭载使羊草细胞发生了变异，这种变异可作为羊草空间诱变遗传育种的重要理论依据。

染色体是遗传信息的载体，染色体变异必然导致遗传变异的发生，是生物遗传变异的重要来源，以染色体畸变率作为检测诱变源的生物效应和遗传效应的指标是比较直接［24］。羊草经空间搭载后其根尖细胞染色体出现染色体单桥、断片、双桥、游离染色体、落后染色体、染色体断片、染色体粘连等多种畸变类型。针对染色体变异类型能否在后代植株中表达、如何表达以及是否出现优异突变体等将会成为今后研究的重点。

试验结果表明，太空诱变处理对羊草种子的萌发能力影响不大，但能够促进羊草种子根尖细胞的有丝分裂、诱导细胞核和染色体发生变异。

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