不同运动方案对果蝇运动能力、生命周期及心脏功能的影响

郑澜 王小月 吴越 林丽容 田旭 吴秀山

1湖南师范大学体适能与运动康复湖南省重点实验室（湖南 长沙 410012） 2湖南师范大学心脏发育研究中心

心脏结构和功能的增龄改变是心脏病的主要危险因素，适宜的体育运动延缓心脏结构和功能的退行性变化已为一些研究证实［1，2］，然其作用的分子机理尚未阐明。以哺乳动物为模型研究生理条件下运动对心脏功能的影响及机理，存在实验动物寿命较长、基因组复杂的局限。果蝇是唯一具有心脏的无脊椎动物，且心脏组织分化精细，是研究心脏遗传与发育基因调控的理想模式动物。由于果蝇生命周期短、表型易于观察、转基因技术成熟，以果蝇为模型进行心脏衰老的研究有明显优势。对果蝇的研究表明胰岛素信号通路和饮食限制对衰老的影响具有进化上的保守性［3-5］，果蝇在钾离子通道影响心脏衰老进程保守性的研究中也扮演重要的角色［6，7］。近年研究亦表明，果蝇可作为研究更高种属心脏的非自律结构调节心脏节律、心肌收缩的模型［8］，抗氧化酶Sod2突变果蝇心脏功能衰退与果蝇生命后期心脏功能表型相似［9］。这些研究进展为果蝇作为研究脊椎动物乃至人类心脏衰老的模式动物提供了有力证据。本研究根据果蝇逆重力爬行的生理特性，在研制果蝇运动平台装置的基础上，研究不同运动方案对果蝇运动能力、心脏功能及生命周期的影响，探讨抗心脏衰老果蝇运动模型的建立。

1 材料与方法

1.1 果蝇及分组

采用野生型w1118品系果蝇（由Rolf Bodmer教授和Karen Ocorr教授惠赠，湖南师范大学心脏发育研究中心保存），扩大培养后收集12 h内羽化雄性果蝇3600只，随机分为6组：空白对照组、1.5 h运动组、2 h运动组、2.5 h运动组、3 h运动组和3.5 h运动组，600 只 ／组，20 只 ／管，恒温 25℃、湿度 50%、12小时昼夜循环饲养。实验在湖南师范大学体适能与运动康复湖南省重点实验室完成。

1.2 果蝇培养基

先将玉米粉504 g、黄豆粉120 g置于锅内加水6.0 L，水温热后加108 g琼脂至完全溶化，小火加热至沸腾略带粘稠后再加入酵母糊149 g、麦芽糖370 g、蔗糖370 g充分搅拌至糊状；停火1～2 min，加入丙酸20 ml、20 g对羟基苯（溶于200 ml无水乙醇），充分搅拌后立即分装于洁净的培养指管中，每管培养基厚度为0.5～1.0 cm。

1.3 运动方案

采用平台运动 （果蝇平台运动装置由课题组自主研制），8天龄开始执行运动方案，培养指管底部培养基至棉塞下端预留8 cm作为果蝇运动区域，运动频率由运动装置的电机转速控制，运动频率（运动装置电机转速）为24秒/转。1.5 h运动组、2 h运动组、2.5 h运动组、3 h运动组和3.5 h运动组周一至周五，每天分别运动 1.5 h、2 h、2.5 h、3 h 和 3.5 h，共3周。

1.4 检测指标

1.4.1 运动能力检测

每次训练前采用视频拍摄测定攀爬指数评定果蝇运动能力，攀爬指数评定方法：试管底部至棉塞下端预留18 cm作为果蝇运动区域，此运动区域由底至上分 1、2、3、4、5、6、7、8、9 九等份（区域），每个区域 2 cm， 各区域相应得分为 1、2、3、4、5、6、7、8、9分。从全部果蝇个体震落至试管底部后第5秒时，计算各区域内果蝇个体数，重复5次震落并计数各区域果蝇个体数。每组随机取样100只，分为5管，每管20只，计算每管每只果蝇得分之和为攀爬指数，以评定运动能力。

1.4.2 生命周期检测

运动结束后，各组取果蝇200只，每2天更换一次新鲜培养基，每天定时观察，记录果蝇死亡数，直到各组果蝇全部死亡为止，制作果蝇半数死亡时间曲线和存活曲线。死亡前一半果蝇寿命的算术平均数为半数死亡时间，全部果蝇寿命的算术平均数为平均寿命，最后20只果蝇寿命的算术平均数为最长寿命，平均延寿率（%）＝（运动组平均寿命－空白对照组平均寿命）/空白对照组平均寿命×100%。统计各组果蝇平均寿命、半数死亡时间、最长寿命和平均延寿率。

1.4.3 心脏功能检测

运动结束后，分别于果蝇31天龄、38天龄时进行心脏功能检测。将果蝇置于麻醉瓶（内含三酰胺麻醉剂，FlyNapTM）麻醉5分钟后，取出整齐排列在两侧涂有导电胶（Signa gel，美国Parker公司）的载玻片上，使果蝇翅膀朝上翻转贴于导电胶，头尾分别与两侧导电胶相连。用脉冲电激仪（PHIPPs&BIRD，美国；测试参数：6 Hz、40 V）循环交流电刺激30 s后立即停止，2 min内在解剖显微镜下观察果蝇心脏跳动变化与心率恢复。

（1）功能正常心脏：有节律地收缩跳动；（2）纤维性震颤：心脏处于一种非正常状态，常表现为剧烈收缩、回旋或者缓慢蠕动等不正常行为；（3）心脏停止跳动。有上述（2）或者（3）表现的果蝇心率不能恢复正常，视为心力衰竭［10，11］。 分别计数心脏纤维性震颤或停止的果蝇数与果蝇总数的百分比，即心脏衰竭率。每组检测果蝇100只。

1.5 统计学分析

所得数据采用SPSS17.0统计软件处理，多组间均数比较采用单因素方差分析，显著性水平为α=0.05和α=0.01。

2 结果

2.1 果蝇攀爬指数

图1显示，果蝇攀爬指数随着年龄的增加而下降。运动第1周、第2周，1.5 h运动组、2 h运动组、2.5 h运动组、3 h运动组、3.5 h运动组攀爬指数与空白对照组相比变化不大，第3周，2.5 h运动组果蝇攀爬指数明显大于其他各组。

图1 不同运动方案对果蝇攀爬指数随年龄变化的影响

2.2 生命周期

表1显示，与空白对照组相比，2.5 h运动组平均寿命增加（P=0.0095），差异具有统计学意义，1.5 h运动组、2 h运动组、3 h运动组、3.5 h运动组无变化；与空白对照组相比，3.5 h运动组半数死亡时间缩短（P=0.0218），差异具有统计学意义，1.5 h运动组、2 h运动组、2.5 h运动组、3 h运动组无变化；与空白对照组相比，1.5 h运动组 （P=0.0094）、2 h运动组（P=0.0089）、2.5 h 运动组（P=0.0074）、3 h 运动组最长寿命（P=0.0098）都出现增加，差异具有统计学意义，3.5 h运动组无变化。1.5 h运动组、2 h运动组、2.5 h运动组、3 h运动组、3.5 h运动组平均延寿率分别为 1.36%、2.87%、5.86%、2.80%、-0.85%。

图2显示，与空白对照组相比，1.5 h运动组、2 h运动组、2.5 h运动组、3 h运动组果蝇半数死亡时间曲线上移、右移，3.5 h运动组半数死亡时间曲线下移、左移。

图3显示，与空白对照组相比，1.5 h运动组、2 h运动组、2.5 h运动组、3 h运动组果蝇存活曲线上移、右移，3.5 h运动组存活曲线下移、左移。

表1 不同运动方案果蝇寿命比较

图2 不同运动方案果蝇半数死亡时间曲线

图3 不同运动方案果蝇存活曲线

2.3 心脏功能

表2显示，31天龄时，空白对照组、1.5 h运动组、2 h运动组、2.5 h运动组、3 h运动组、3.5 h运动组果蝇心脏衰竭率分别为 56%、58%、52%、46%、57%、69%；38天龄时，空白对照组、1.5 h运动组、2 h运动组、2.5 h运动组、3 h运动组、3.5 h运动组果蝇心脏衰竭率分别为 71%、68%、65%、62%、74%、80%。

表2 果蝇心脏衰竭率检测结果

3 讨论

果蝇以不定向飞行运动为主，如何让其根据规定的运动方向持续运动成为对果蝇实施运动方案首先需要解决的问题。本研究前期根据果蝇逆重力爬行的生理特征，自主研制了果蝇运动平台装置（已申请国家发明专利），通过观察果蝇的运动情况和身体状况，设置平台由8.5 cm高落下，所产生的冲击力可使果蝇震落至培养指管底部，果蝇将自主运动至培养指管顶部棉塞处，选择24秒重复1次，实现了果蝇运动时间与频率可控的定向运动，以研究5种不同持续时间的运动方案对果蝇运动能力、生命周期和心脏功能的影响。

常用攀爬指数评价果蝇运动能力［12］，也可评估果蝇随增龄发生的身体活动能力的变化［13，14］。本研究中，果蝇从8天龄开始运动（相当于人的青春发育初期），进行5种不同方案运动，每天分别运动1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h，在运动第 1 周、第 2 周，各运动组攀爬指数与空白对照组相比变化不大，第3周，各组果蝇攀爬指数呈下降趋势，但2.5 h运动组果蝇攀爬指数明显大于其他各组，表明随着年龄的增加，每天运动2.5 h作为适宜的运动，对维持果蝇运动能力、抵抗增龄衰退的效果显现出来。果蝇生命周期结果显示，持续 3 周、每天运动 1.5 h、2 h、2.5 h、3 h 的果蝇，其存活曲线和半数死亡时间曲线上移、右移，而3.5 h运动组果蝇存活曲线和半数死亡时间曲线下移、左移。仅每天运动2.5 h果蝇的平均寿命增加，而运动3.5 h的果蝇半数死亡时间缩短 （P<0.05），且每天运动 1.5 h、2 h、2.5 h、3 h可增加果蝇的最长寿命 （P<0.01），1.5 h、2 h、2.5 h、3 h 各运动组平均延寿率分别为1.36%、2.87%、5.86%、2.80%，而3.5 h运动组平均延寿率为-0.85%。持续3周、每天2.5 h的运动可作为果蝇延长生命周期的适宜运动，而每天运动3.5 h可能过量运动，会缩短生命周期。

正常老年人随年龄增长心脏功能下降［15］，逐渐出现心律失常和心力衰竭［16，17］。年龄相关的心功能不全和心力衰竭的哺乳动物模型因其寿命较长和心脏正常功能是存活所必需的条件，进行心脏衰老机理的研究有较大局限性。与啮齿类动物相比，果蝇寿命只有数周（约2个月），果蝇机体所需氧气由气管系统供应完成，心脏处于危险状况不会导致个体过早死亡［17，18］。 故本研究应用果蝇心力衰竭模型，将 31天龄、38天龄的成体果蝇放在导电的载玻片上，通过电极短暂刺激30秒，使果蝇的心跳频率由正常的3 Hz增加到6 Hz，停止后检测果蝇心率恢复情况，不能恢复正常心跳频率或出现纤维性震颤的果蝇视为心力衰竭。该模型可检测年龄与心力衰竭发生的相关性，判断心脏功能随增龄而衰退的变化［10，11］。 持续3周、每天运动1.5 h至2.5 h的果蝇在31天龄和38天龄时其心脏衰竭发生率下降，每天运动2.5 h的果蝇心脏衰竭发生率明显下降，而每天运动3.5 h的果蝇心脏衰竭发生率明显高于空白对照组，表明从8天龄开始，进行持续3周、每天1.5 h至2.5 h的运动可缓解果蝇心脏衰竭的发生，延缓心脏功能随增龄而衰退，其中以每天2.5 h的运动效果最佳，每天超过3 h的过量运动不利于维护心脏功能。

因此，建议采用每天2.5 h、持续3周的运动方案建立抗心脏衰老果蝇运动模型，进行运动延缓衰老的基因功能筛选和机理研究。

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