冷应激游泳和冷适应游泳对大鼠心肌和脑组织ATP酶、钙离子及自由基代谢的影响

王一璇吕国枫 刘彦娜 刘克敏 刘丽红 阎平

1大连医科大学运动医学教研室（辽宁 大连 116044） 2河北医科大学附属石油医院康复科

冬泳是一项在冷环境中强度较大的运动。长期规律冬泳能改善机体功能状态，增强体质，预防各种老年性疾病的发生［1］。但冬泳造成猝死的病例时有报道［2］，大部分为心脑血管和血栓栓塞性疾病。目前，关于冷环境下的应激和适应性运动对机体的影响，以及低温、运动强度和时间三者对冬泳效果影响的分析甚少。本实验参考以往关于不同温度和运动时间冬泳时机体反应的实验报道，采用冷适应游泳和冷应激游泳两种冬泳动物模型，观察二者对大鼠心肌、脑自由基代谢、ATP酶活性和Ca2+含量的影响，探讨冷适应冬泳运动对机体的保护性塑性改变，为冬泳健身提供理论依据，预防各种冬泳运动性损伤的发生。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选用纯系普通清洁级雄性S D大鼠30只，10月龄左右，体重（285±15）g。由大连医科大学动物实验中心购入，许可证号：（辽）2008-0002，动物批号026，同时购入基础饲料。饲于通风清洁动物房，温度（20±3）℃，相对湿度（50±5）%。 分笼饲养，每笼 3～4只。自然光照，自由进食饮水。大鼠适应性饲养3天后随机分成3组：对照组、冷应激游泳组和冷适应游泳组，每组10只。本实验在大连医科大学运动医学实验室一室完成。

1.2 建立动物模型

游泳条件：塑料圆筒，直径80厘米，桶壁光滑，水深60厘米，为大鼠身长的2倍以上。为避免动物间的干扰，每桶3～4只大鼠。游泳过程中用玻璃棒驱赶大鼠以防其漂浮水面。游泳结束后用干燥毛巾擦干大鼠。

实验方案：（1）对照组不运动，实验第7周处死。（2）冷应激游泳组不运动，第6周末进行适应性游泳3天，每天1次，水温30℃，15 min。 第7周在 8℃水温中运动1次，时间8 min，运动后即刻处死。（3）冷适应游泳组：适应性游泳训练3天，每天1次，水温30℃，时间15 min。之后进入正式训练：每天1次，起始水温30℃，时间40 min，从第2天起水温每天下降2℃，时间每天缩短3 min，每周训练6天，持续2周［3，4］，从第 3 周起，水温保持在 10℃，时间 5 min，持续训练4周。第7周，在8℃水温中运动1次，时间8min，运动后即刻处死。

1.3 标本采取及处理

断头处死大鼠，迅速剪下头部放于冰台上，取出脑组织。迅速剪开腹腔，取出心脏，在冰生理盐水中浸泡，洗净残余血液，滤纸吸干水分后装进样品瓶。将心、脑组织放置于-80℃冰箱备用。剪取适量组织，加入预冷的匀浆介质制成10%组织匀浆，普通离心机2500 r/min离心15 min；用于检测ATP酶的组织匀浆采用1000 r/min离心5 min。将10%组织匀浆上清用生理盐水按1∶9稀释成1%组织匀浆，将10%组织匀浆上清用生理盐水按1∶4稀释成2%组织匀浆。将各浓度组织匀浆液上清放置于4℃冰箱中备用。

1.4 测试指标与方法

各组大鼠每周称重1次，实验期间共测7次。组织蛋白测定采用考马斯亮兰法。丙二醛（MDA）含量测定采用硫代巴比妥酸（TBA）法。超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用黄嘌呤氧化酶法。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性测定采用无机磷法。Ca2+含量测定采用甲基百里香酚蓝比色法。

1.5 统计学分析

应用SPSS 11.5统计软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，各组间比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05，P<0.05为有统计学意义，P<0.01为有显著统计学意义。

2 结果

2.1 体重

如表1所示，实验前3组大鼠体重均无显著性差异。实验结束时，冷适应游泳组体重显著低于对照组和冷应激游泳组（P <0.01）；冷应激游泳组体重与对照组相比无显著性差异（P>0.05）。

表1 三组大鼠体重比较（g）

2.2 MDA含量和SOD活性

从表2可见，冷应激游泳组心、脑组织MDA含量显著高于对照组 （P<0.01），SOD活性显著降低（P<0.01）；冷适应游泳组心、脑MDA含量和SOD活性与对照组相比无显著性差异 （P>0.05），MDA含量显著低于冷应激游泳组 （P<0.01），SOD活性显著高于冷应激游泳组（P<0.01）。

表2 三组大鼠心、脑组织MDA含量和SOD活性比较

2.3 Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性和Ca2+含量

如表3所示：冷应激游泳组心、脑组织Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性显著低于对照组 （P<0.01）；冷适应游泳组心、脑组织Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性与对照组相比无显著性差异 （P>0.05），与冷应激游泳组相比显著升高（P<0.01）。冷应激游泳组心、脑组织Ca2+含量与对照组相比显著升高（P<0.05，P<0.01）。冷适应游泳组心、脑组织Ca2+含量与对照组相比无显著性差异（P >0.05），但与冷应激游泳组相比显著降低（P<0.05）。

表3 三组大鼠心、脑组织Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性和Ca2+含量比较

3 讨论

3.1 大鼠体重变化

本实验过程中我们观察到，冷适应游泳组大鼠在冷水运动中的寒战频率较冷应激游泳组大鼠明显减少。实验取材中发现冷适应游泳组大鼠腹部脂肪含量与对照组和冷应激游泳组大鼠相比也明显减少。实验结束时冷适应游泳组大鼠体重明显低于对照组和冷应激游泳组。当机体处于冷环境中，势必加大能量消耗，冷水中运动，传导散热可使体热丢失增加［5］，引起低体温。冷应激个体以寒战产热为主，造成肢体血流量增加，组织隔热作用减小，机体散热量反而更多，同时骨骼肌不随意的周期性收缩，耗氧多，耗能多，干扰了肌肉运动的目标性和协调性，降低了运动耐受性，容易造成疲劳和损伤。有研究表明［6］：在寒冷条件下的运动改变能量底物的循环水平，增加肌肉受伤。冷适应个体冷暴露时寒战动作明显减少，主要是非寒战产热完全替代或部分替代寒战产热，此时耗氧量明显增加而肌电活动增加不明显［7］。这种非寒战产热与棕色脂肪组织（BTA）密切相关［8-10］。有动物实验表明，冷适应的建立过程主要由交感神经系统调控棕色脂肪组织增加产热完成［8］。从细胞和分子水平看，是棕色脂肪组织中与产热有关的重要组分，如解偶联蛋白［10-12］、甲状腺素-5’-脱碘酶［9］和脂蛋白脂酶基因表达上调的过程。冷适应过程中，去甲肾上腺素在转录水平诱导解偶联蛋白的转录，促进脂蛋白脂酶合成增多，加速血浆脂蛋白中甘油三酯的分解，从而可以达到降低体脂控制体重的作用。

有报道表明［5］：机体在冷环境中的产热效率受到个体体脂率的影响。体脂率低的个体较体脂率高的个体在冷环境中其产热系统更为活跃，产热效率更高。体脂率低的个体较体脂率高的个体在冷环境中体表温度和四肢末梢温度更高。另有研究表明［13］：机体原始的体脂率对运动过程中机体的脂肪利用率有影响。体脂率高的肥胖个体较体脂率低的正常个体其对交感刺激的敏感性降低，脂肪动员要少，从而对产热作用的依赖性要小［14］。反过来长期的运动过程又可以对机体原始体脂率进行重塑调节。体脂率高的个体在运动训练中脂肪含量逐渐减少，而体脂率低的个体则有所增加。可见产热率、体脂率与运动相互作用影响。结合本实验结果：冷适应游泳组大鼠解剖时腹部脂肪含量明显减少，大鼠体重亦明显减少。寒冷环境运动中体脂下降可能归因于蛋白质合成增多、脂肪酮化及能量消耗。鉴于现实生活中冬泳运动结合了寒冷和运动双重因素，本次研究初衷模拟冬泳运动模型，实验设计没有将这两个因素分离开来。冷适应建立过程伴随机体体脂减少，可使体内非寒战产热作用增强，产热组织 （脂肪组织和骨骼肌）对 β-肾上腺素受体的敏感性增加［15-17］，低的体脂率可能对交感刺激更为敏感，能更好地调动其产热功能维持核心温度，从而增强了体质，提高了机体在冷环境中对运动的耐受力［13，14］。 除上述分析外，长期的运动训练过程也会使能量消耗增大，从而可能起到分解脂肪的作用，冷适应游泳组较对照组和冷应激游泳组体重减轻，可能是这两个因素综合作用的结果。今后的研究可以在此基础上，进一步添加单独运动组和单独冷适应组，将冷适应和运动分离开来，观察其体重体脂的变化。

3.2 冷应激和冷适应游泳对组织氧化损伤和抗氧化系统的影响

本实验发现：冷适应运动组心肌和脑组织MDA含量明显低于冷应激运动组（P<0.01）；SOD活性明显高于冷应激运动组（P<0.01）。机体的氧化应激损伤主要是指氧自由基及其诱发的脂质过氧化产物对细胞脂质微环境的破坏作用。正常情况下，体内不断产生活性氧，但并未对机体造成严重损害，其原因在于体内存在抗氧化机制。

冬泳运动结合了寒冷和运动两个因素，单寒冷因素作为应激源，可使机体内环境的稳定性、生理和行为等发生改变［5，18］。 实验发现［19］，冷应激可造成大鼠下丘脑和肾上腺髓质SOD活性下降。Kaushik［20］报道，冷应激导致大鼠各组织氧化应激和抗氧化系统的改变，冷应激组脑、心、肾、肝和小肠MDA含量多于对照组，且GSH、SOD、GR含量明显低于对照组。而冷适应对氧化和抗氧化系统具有调节作用，其可能是通过较长期的抗氧化适应完成［21］：长期暴露于冷环境中，其寒冷引发的高代谢率伴随大量氧自由基的产生，从而造成氧毒性使机体脂质过氧化作用增强，机体随之通过SOD和GSH-Px的活性增强进行适应性改变，对氧化损伤进行修复调节，从而达到最终的平衡状态。对于另一个因素运动而言，这一抗氧化适应机制同样可以解释为什么长期运动训练能够减少组织氧化应激损伤，提高机体抗氧化的能力［22］。可见抗氧化适应机制可能是寒冷和运动两因素对机体抗氧化系统产生影响的共通作用环节。有研究报道［23］，冷环境中运动组与对照组相比组织LPO、MDA、8-羟基脱氧鸟苷升高。另有实验发现：冷暴露可增强运动诱导的氧化应激［24］。本实验也显示了相似的结果：冷应激游泳导致大鼠心肌和脑组织氧化应激水平增强，抗氧化能力减弱，对机体造成了损害。冷适应游泳运动与冷应激游泳相比降低了大鼠心肌和脑的氧化损伤，增高了组织的抗氧化应激水平。其抗氧化适应可能是冷适应游泳发生抗氧化塑性改变的不可分割的一部分，这种特殊的适应过程可能包括抗氧化体系的激活、氧化损伤修复／清除体系的干预、改变氧化还原敏感性转录等［22］，进而引起基因和蛋白表达的变化［25］，这在今后的研究中需要进一步深入。寒冷和运动刺激所导致的急性活性氧增加和长期的抗氧化适应是冷水运动增强体质的一种分子机制［1，21］。机体通过对活性氧产生的适应性，诱导加强抗氧化系统，从而提高了组织清除自由基的能力，有利于建立良性的循环，最终引起抗氧化防御系统的运动适应。这也为探讨冷适应游泳提高机体耐寒能力提供了一条新的途径。

3.3 冷应激和冷适应游泳对组织ATP酶活性和Ca2+含量的影响

本实验发现：冷适应运动组心肌和脑Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性明显高于冷应激运动组，组织Ca2+含量明显低于冷应激运动组。这一差异可能同样是寒冷和运动双重因素的作用结果。以往的研究表明，急性力竭运动可以导致内源性自由基增多。同样效果，冷环境下的运动也会造成自由基的过多生成。在寒冷和运动的综合作用下，脂质过氧化反应增强，对机体造成损伤。而许多实验证实自由基与酶活性的改变有着密切关系［26-28］。Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+-ATP 酶是广泛分布在机体内的生物膜酶系统，它们对维持细胞的正常生理功能起着极其重要的作用。正常情况下，细胞内游离钙浓度远低于细胞间隙钙浓度。当机体内活性氧生成过多时，增强的脂质过氧化反应可攻击细胞膜的Na+-K+-ATP酶，降低Na+-K+-ATP酶活性，引起胞内Na+含量的增多，进而刺激了Na+-Ca2+交换，使细胞外钙内流增加，引起细胞内的钙超载。自由基对胞膜Ca2+-ATP酶造成的损伤，降低了细胞对钙的排出作用，进而加重细胞内的钙聚集。由于胞浆钙的增加，会刺激线粒体膜钙泵主动摄取钙，缓解胞浆钙升高的破坏作用。但线粒体钙的再聚集抑制了一些呼吸链关键酶的活性［29］，影响了线粒体的氧化磷酸化过程，使氧化磷酸化解偶联，ATP生成减少，能量供应障碍。此时若胞浆钙继续升高，将会引起线粒体肿胀，诱发 PIP 开放［30］，引起 Ca2+外逸，这又刺激了活性氧的再生成，反馈性恶性循环导致胞浆钙的突增。钙离子可以通过结合钙调蛋白从而激活各种蛋白激酶，诱发细胞凋亡，最终导致细胞的损伤。

肌细胞膜的Na+-K+-ATP酶活性下降，降低了动作电位的传导速度和高度，甚至可能引起动作电位的完全灭活，从而影响运动时的肌张力［31］。同时升高的血浆儿茶酚胺浓度可以激活肌细胞Na+-H+交换蛋白，使得肌细胞摄取钠而排出钾，进一步造成了细胞内高钠的状态，Na+浓度的升高会反馈性地抑制Na+-H+交换蛋白的活性，使肌细胞内的H+浓度反常升高，这种偏酸性环境会降低Ca2+与肌钙蛋白的结合力，减少了活化横桥的数目，引起横桥的摆动频率降低，肌力下降。

本实验结果显示：急性冷应激游泳造成了机体高的氧化应激水平，增多的自由基损害了组织细胞Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶，进而造成细胞钙的集聚，对机体造成伤害。冷适应游泳与冷应激游泳相比，通过长期的抗氧化适应改善了机体的氧化应激状态，增加了抗氧化酶的活性，降低了自由基水平，提高了ATP酶的活性，进而有利于组织正常钙含量的维持。

综上所述，冷环境下运动会导致机体氧化应激水平增强。长期的冷适应运动可以通过氧毒性适应提高机体的抗氧化能力。冬泳是一项运动和寒冷相结合的运动。这一双因素刺激所导致的急性活性氧增加和长期的抗氧化适应是冬泳增强体质的分子机制。本实验采用大鼠冷应激和冷适应游泳方法来建立冬泳动物模型，分析这两种冬泳模式对机体的影响。实验显示冬泳对机体的影响取决于之前对冷运动的适应。对于没有适应者，冷水运动会对其机体造成有害结果；然而，规律冬泳训练者，生理上产生了适应，增加了对冷的耐受力，冷适应运动使其机体产生了可塑性的改变，进而这种适应机制会保护机体抵抗各种疾病的发生。今后的研究可以从氧化损伤修复∕清除的相关基因表达，及氧化还原敏感性转录的改变等方面进行更深入的展开。此外，本实验也为今后的低温运动、运动时间和运动强度这三因素的研究提供了实验依据。此外，本实验发现长期的冷适应游泳与对照组和冷应激组相比在控制体重方面有显著的作用，今后添加单独运动组和单独冷适应组，进一步比较寒冷和运动对体重的影响，可以从脂肪代谢相关酶的活性改变、基因表达调控方面做进一步的深入研究。

4 总结

长期的冷适应游泳对于控制体重有很好的效果。冷适应运动能明显降低心肌和脑组织的脂质过氧化程度，提高抗氧化系统的能力，使机体对冷运动应激的适应性增强。冷适应运动能通过长期的抗氧化适应改善心肌和脑组织的ATP酶活性，维持组织正常钙含量。

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