微生态制剂(EM-1号原液)对金鲫鱼淀粉酶的影响

2012-05-10王羽

海峡科学 2012年5期

王羽

王羽

福州教育学院

利用不同剂量的微生态制剂( EM-1号原液)添加在饲料中饲养金鲫鱼5周,测定金鲫鱼外部生长指标以及与鱼生长有密切相关的淀粉酶活性、活力指标。结果显示:试验组的淀粉酶活性、活力等生长相关指标均优于对照组，且随着EM-1号原液添加剂量的增加而提高，表明EM-1号原液能改善金鲫鱼生长指标，提高机体的新陈代谢，加快生长速度。

微生态制剂（EM-1号原液）金鲫鱼生长淀粉酶指标

微生态制剂是绿色饲料添加剂[1]。目前，复合微生态制剂在水产养殖上的应用已越来越受到广大养殖者的关注，它是近十年发展起来的新型微生物饲料添加剂，根据微生态理论研究研制的微生态制剂体现出许多优越性：可以克服滥用抗生素引起的鱼类内源性感染或二重感染，并且在取代抗生素方面体现出特有的优势，它有抗生素和酶的功能，可提高饲料转化率，预防疾病，促进生长；它具有显著增强其免疫功能、抗病、促生长、提高饲料利用率等特点[2]。

EM-1号原液是一种比较常见的微生态制剂，目前在整个水产养殖中大多是直接作用于水体，能抑制病原微生物和有害物质调节生态环境，提高水中的溶氧量，促进养殖生态系统中的正常菌群和有益藻类活化生长，保持养殖水体的生态平衡[3]。若拌入饵料投喂，可直接增强鱼类的吸收功能和防病抗病能力，促进其健壮生长。但是EM-1号原液在鱼类上发挥抗病、促生长、提高饲料利用率机理的研究较少，本试验旨在通过对饲喂不同浓度EM-1号原液的金鲫鱼，了解添加EM-1号原液对其生长和淀粉酶活性、活力指标的影响，为合理配制饲料，改善鱼体质，实现鱼类的健康养殖提供一定的理论依据。

1 实验材料及方法

1.1 实验用鱼

金鲫鱼（）购自于泉州东街市场，健康，在实验室内暂养2天后进行试验。

1.2 实验用微生态制剂

微生态制剂选用EM-1号原液。EM是英语Effective和Microorganisms的缩写，不含任何化学有害物质，无毒副作用[4]，无残留和二次污染，不产生抗药性。

原料组成：光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、发酵丝状菌群、革兰氏阳性放线菌及糖蜜等。

质量标准：有效活菌数不少于108(亿)/ mL、pH值小于3.5，棕色半透明液体，由5科10属80多种有益微生物复合培养而成。

1.3 实验试剂及药品

考马斯亮蓝G-250、KH2PO4、NaHPO4·2H2O、双蒸水、可溶性淀粉、95%乙醇、HCl、NaCl、3,5—二硝基水杨酸、NaOH、酒石酸铜钠、结晶小牛血清蛋白(BAS)、麦芽糖，磷酸缓冲液pH7.0（0.067mol/L）、淀粉溶液1%等。

3,5—二硝基水杨酸试剂：称取3,5—二硝基水杨酸2.25g，溶于100mL 12mol/L的NaOH溶液中，再加入少量的蒸馏水，加入150g酒石酸钠，待溶解后用蒸馏水定溶至500mL。盖紧瓶塞，勿使CO2进入，若溶液浑浊，可过滤后使用。

考马斯亮蓝染液的配制：先称取0.125g考马斯亮蓝G-250溶于100mL95％乙醇中。（烧杯定容）然后量取15mL 37％HCl, 称取5.06g NaCl于双蒸水中。将上面两种溶液混合定容至1000mL，过滤后取滤液(需要较长时间，棕色瓶装考马斯亮蓝染液)。

牛血清标准蛋白液的配制：用电子天平准确称取牛血清白蛋白0.060g，溶于4mL双蒸水中配置成15mg/mL牛血清标准蛋白液，按照一定比例以15mg/mL牛血清标准蛋白液分别稀释成12mg/mL、10mg/mL、8mg/mL、6mg/mL、5mg/L、3mg/mL的标准蛋白液。

1.4 实验仪器

分光光度计（7220型）、SiGmA高速冷冻离心机、电子天平、冰箱、烘箱、电炉、恒温水浴锅、移液枪（0.5～10μL）、玻璃匀浆器、50mL棕色定容器、100mL棕色容量瓶、必备的化学器皿等。

1.5 实验方法

1.5.1 微生态制剂的添加剂量和方式

试验鱼每日按体重的3%～5%比例投饵,于8: 00和17: 00分2次投喂。对照组投基础饵料，试验组投食喷有微生态制剂的饵料分为C0（对照组）、C1、C2、C3。实验组在基础饵料中分别加入不同浓度的微生态制剂。

表1 不同实验组饲料中EM-1号原液的添加量

1.5.2 粗酶液制备

取出组织样品，剔除附着物，称重，每克组织中加入4mL重蒸馏水，于冰浴中，进行匀浆，将匀浆液装入10mL的塑料离心管中，用冷冻离心机于0℃，11000r/min离心40min，上清液即为粗酶提取液，暂存于-20℃冰箱中，24小时内测定蛋白含量和淀粉酶活性。

1.5.3 生长性能测定和饵料系数的计算

饵料系数(F/G)=投饵量/鱼体增重量，即F/(W2-W1)。

相对增重率(RGRW)=( W2-Wl)/W1×100%。

1.5.4 pH值变化测定

pH值对鱼类生理活动的影响是多方面的[5]。pH值也是水质的重要指标，对鱼类等水产动物的高产、稳产具有重要作用，每隔5天测定水体pH的变化情况。

1.5.5酶蛋白质含量的测定

粗酶中蛋白含量用考马斯亮蓝法测定[6]。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内(1～100μg)，蛋白质与色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。

1.5.5.1蛋白质标准曲线的制定

在比色杯中用移液枪加入2mL的考马斯亮蓝染液和5μL的双蒸水作为空白液，在波长595nm处比色；同样在2mL的考马斯亮蓝染液中加入上述几个浓度梯度小牛血清标准蛋白液测定吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度(μg／ml)作为横坐标作图得标准曲线，如图1所示。

图1 小牛血清蛋白标准曲线

1.5.5.2粗酶液蛋白质含量的测定

用移液枪取2mL的考马斯亮蓝染液直接加入比色杯中，再加入5μL的待测酶液，搅拌均匀，于波长595nm处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。

表2 粗酶液蛋白质含量的测定

1.5.6麦芽糖标准曲线的制定

参考任永波等方法，因为淀粉酶水解产物麦芽糖及其还原糖能与3,5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定的范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，所以酶活力可以用麦芽糖（或葡萄糖）浓度表示，用比色法测定淀粉酶生成还原糖的量，以单位时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。具体的步骤如下，用7支干净的有刻度的试管并编号，按表3加入各试剂。

表3 麦芽糖标准曲线制作方法

摇匀后，置沸水中煮沸5min，取出后冷却，加蒸馏水定溶至10mL。以1号管空白调零，在540nm处比色测定。以麦芽含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线如图2所示。

1.5.7 淀粉酶活力测定

参照沈文英等方法，在具有刻度的试管中加入用pH7.0，0.067mol/L磷酸缓冲液配制1%的淀粉溶液0.5mL，酶液0.5mL，摇匀；置于25℃水浴中，保温3min；再加入3,5-二硝基水杨酸指示剂溶液2.0mL，置于沸水中5min，取出流水冷却，定溶至10mL，可见光分光光度计540nm处比色，记录吸光值，查麦芽糖标准曲线得知麦芽糖含量。在25℃条件下，每分钟催化淀粉生成1.0μg麦芽糖作为一个活力单位。

计算公式：

淀粉酶活力（U）=麦芽糖微克数×粗酶液稀释倍数/反应时间

淀粉酶比活力（U/mg.Pr）=淀粉酶总活力/蛋白含量

淀粉酶比活力定义为每克新鲜组织的酶活力单位（U/g），脂肪酶比活力为每升酶液的酶活力单位。

2 实验结果及分析

2.1 生长性能测定和饵料系数的计算

表4 试验前后鱼体重量变化

表5 各个实验组测定指标

2.2 pH值变化测定

pH值对鱼类生理活动的影响是多方面的[5]。pH值也是水质的重要指标，对鱼类等水产动物的高产稳产具有重要作用。

图3 pH值变化折线图

EM-1号原液复合微生物制剂对养殖水pH值的影响水体中的pH值变化折线图显示，4组pH值的变化情况相差不大，但是对照组相比之下波动较大。试验池水质的pH值平稳，始终保持在7.25～7.56范围内；而对照池水质的pH相比波动大，在7.26～7.66范围波动。pH变化主要是水体中藻类的光合作用所致，pH值变动越平稳，则说明藻菌的动态生态效果越好，可防止水环境产生陡变，避免养殖生物产生应激反应，同时有利于水中污染物高效率地降解、转化和有益微生物较好发挥作用[7]。

同时，有研究表明，EM-1号原液不仅对水体有作用，对饲料也具有明显的酸化作用[8]，将饲料酸化后可以改善动物的生产性能[9]。饲料酸化后，可使胃内pH值下降。这对于消化系统尚未发育的幼龄动物来说，作用更明显[10]。

当然，微生态制剂对养殖水体的生物修复也存在自身的局限性。例如，微生态制剂中特定的有益菌株只能降解特定类型的化学物质，状态稍有变化的化合物可能不会被同一微生物酶破坏；微生态制剂不能降解所有进入养殖水体的有毒有害物质，这些物质的难生物降解性、不溶性以及与土壤腐殖质或泥土结合在一起常常使生物修复不能进行等等。

2.3 淀粉酶活性测定

淀粉酶活性测定方法参照张龙翔等(1981)、蒋传葵(1982)，以1.0%可溶性淀粉作底物，用分光光度计于540nnl测出吸光值(A)。用1.0mL标准麦芽糖溶液作同样的操作(标准空白以等体积蒸馏水替代标准麦芽糖溶液)。淀粉酶活性单位：1g新鲜组织在25℃、pH8.0条件下，1min内使可溶性淀粉分解产生麦芽糖的微克数表示(μg'maltose/g*min)。

表6 淀粉酶吸光值

取值：各个组别取最高值进行计算，C0为1.181, C1为1.482, C2为1.701, C3为1.715。

查上表得知各组麦芽糖含量(mg)分别是：C03.583，C14.625，C25.383，C35.431。

C0:淀粉酶活力（U）=3.583×20/3=23.887

淀粉酶比活力（U/mg.Pr）=23.887/6.932=3.446

C1:淀粉酶活力（U）=4.625×20/3=30.833

淀粉酶比活力（U/mg.Pr）=30.833/7.234=4.262

C2:淀粉酶活力（U）=5.383×20/3=35.887

淀粉酶比活力（U/mg.Pr）=35.887/7.643=4.695

C3:淀粉酶活力（U）=5.431×20/3=36.207

淀粉酶比活力（U/mg.Pr）=36.207/7=4.982

试验结果表明，投喂EM-1号原液微生物制剂后，试验组肝胰脏淀粉酶活性均比对照组显著提高。推测EM-1号原液微生物制剂能为金鲫鱼提供外源脂肪酶，促进饲料中脂肪成分的消化，从而提高了饲料的消化利用率。刘江军等[11]、黄永春等[12]利用EM在养殖鱼类试验中发现，将EM添试验组的成活率均高于对照组，试验各组增重率均优于对照组；蒲红宇等[13-14]的研究结果表明，微生物制剂对鱼类淀粉酶活性有明显提高，从而促进消化道分解酶活性提高，促进了鱼类对饲料的消化吸收和鱼类生长。由此我们可推测肝胰脏是淀粉酶生成的主要器官，其分泌机能的强弱直接影响鱼类对食物中淀粉的消化能力。淀粉酶活性增强也是促进金鲫鱼生长的重要因素。

EM—1号原液不仅具有提高饵料生物的品质和对饵料的摄食量以及消化吸收的能力，以促进生长，而且能改善水质环境。本试验组鱼体的淀粉酶活性、活力和生长速度明显高于对照组，也反映了EM—1号原液在促进鱼体生长、改善增重和增加免疫力[15]效果方面所起到的积极作用。

3 前景

微生态制剂可以提高鱼类淀粉酶活性已为众多实验所证实，但对其机理研究较少，目前有学者认为：一些益生菌能产生多种酶类参与动物消化道的“酶池”，并提高动物消化酶活性，促进动物对营养物质的消化吸收。Sogarrd[16]报道，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌具有较强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，同时还具有降解植物饲料中非淀粉多糖的酶。总之，微生态制剂提高鱼类淀粉酶活性的机理还知之甚少，有待于进一步研究，随着研究的深入，微生态制剂在水产养殖业中的运用将会有更加辉煌的明天。

[1] 刘长忠.微生态制剂和有机酸对鲤鱼生长性能最适结合水平的研究[J].

[2] 罗辉，周剑，叶华. 微生态制剂对鱼类肠道结构和消化酶活性的影响.

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