抗生素对玉米愈伤组织生长和分化的影响

李海霞，孙金花，郭志民，胡彦民

(1.河南农业大学生命科学学院，河南郑州450002;2.河南农业大学农学院，河南郑州450002)

玉米转基因技术中，用含有适当抗生素或营养物质的培养基可筛选出转化细胞.目前，多以草丁膦和潮霉素进行筛选［1，2］，前人对二者的适宜剂量进行了大量研究，但是，研究时所用的试验指标多局限愈伤组织存活的范畴［1，3，4］，而有关抗生素对玉米愈伤组织再生影响的研究较少.不同的抗性标记基因所适用的抗生素种类不同，不同的材料所用的适宜浓度也有不同.遗传霉素(G418)和卡那霉素(Kan)是常用的抗生素，且价格低廉.本研究利用这2种抗生素，对玉米愈伤组织生长和再生两方面的影响进行了研究，以期筛选出适合玉米愈伤组织的抗生素剂量，同时也对抑菌剂头孢霉素(Cef)进行了研究，以求在转化后能最大程度地减小对愈伤的伤害.

1 材料与方法

1.1 材料

试验选用玉米自交系87－1和杂交种87－1×郑22、齐319×87－1、郑22×P2、87－1×齐319、昌7－2×HiⅡA等继代培养的胚性愈伤组织为材料.

1.2 基本培养基

继代培养基:N6+2.0 mg·L－12，4 － D+700 mg·L－1脯氨酸 +500 mg·L－1水解酪蛋白 +30 g·L－1蔗糖.

分化培养基:N6+1.0 mg·L－16 － BA+1.0 mg·L－1KT+700 mg·L－1脯氨酸 +500 mg·L－1水解酪蛋白+30 g·L－1蔗糖.

预处理培养基:N6+700 mg·L－1脯氨酸+500 mg·L－1水解酪蛋白 +30 g·L－1蔗糖

1.3 方法

1.3.1 卡那霉素敏感性测定的试验设计 将继代培养的齐319×87－1、郑22×P2的愈伤组织切成2 mm大小块状，分别转移到含有不同质量浓度Kan的继代培养基中进行培养.培养基设卡那霉素质量浓度0(CK)，3，6，10，15，20 mg·L－16 个处理(抗生素过滤灭菌，在培养基灭菌后，冷却到60℃时加入抗生素，混合均匀后倒入培养皿).每个处理设置10个重复，每个重复20块愈伤组织，每次接种到抗性培养基时，称量初始愈伤的重量，2周后称量愈伤组织终重，计算愈伤组织的平均生长量，其间观察愈伤组织的形态与特征.第1次抗性处理后一部分继续进行第2次卡那霉素继代处理，质量浓度处理同第1次卡那霉素处理一样，设置6个重复，每个重复20块愈伤组织;另一部分先进行分化预处理后转入分化培养基进行分化处理，设置6个重复，每个重复10块愈伤组织.置于光下培养，光照时间为 16 h·d－1，光照度 2 500 ～3 000 lx，培养温度为26℃，每周统计1次绿色愈伤率、再生苗率、生根率和褐变率.2次卡那霉素继代处理后的愈伤全部转入分化培养基，进行再生试验.

平均生长量=(初始愈伤质量－愈伤终质量)/初始愈伤质量

再生苗率=(出苗的愈伤组织块数/接种的愈伤组织块数)×100%

生根率=(生根的愈伤组织块数/接种的愈伤组织块数)×100%

褐变率=(褐变的愈伤组织块数/接种的愈伤组织块数)×100%

1.3.2 G418敏感性测定的试验设计 预先将87－1，87－1×郑22的愈伤组织进行扩繁，培养基中加入质量浓度分别为 0(CK)，15，25，35，45，55，70 mg·L－1的 G418.基因型87－1处理设置10个重复，87－1×郑22处理设置6个重复，每个重复20块愈伤组织.第1次抗性处理后各质量浓度愈伤组织全部转入分化预处理培养基，7 d之后转入分化培养基，进行再生试验，设置4个重复，每个重复10块愈伤组织，并统计愈伤组织平均生长量、再生率、生根率、褐变率.

1.3.3 头孢霉素对愈伤组织继代及再生的影响的试验设计 预先将87－1×齐319、昌7－2×HiIIA的愈伤组织进行扩繁，培养基设头孢霉素质量浓度为0(CK)，100，200，300，400，500，600 mg·L－1，每个处理设置6个重复，每个重复放置20块愈伤组织.第1次抗性处理后一部分进行2次头孢霉素继代处理，质量浓度处理同第1次头孢霉素处理一样，设置6个重复，每个重复20块愈伤组织;一部分进行分化处理，设置5个重复，每个重复10块愈伤.2次头孢霉素继代处理后的愈伤全部转入分化培养基，进行再生试验，并统计愈伤组织平均生长量、再生率、生根率、褐变率.

2 结果与分析

2.1 Kan对愈伤组织生长及分化的影响

2个基因型的不同处理对Kan反应较一致，当Kan质量浓度为3 mg·L－1时，各处理的愈伤组织平均生长量均高于对照，其后，随着Kan质量浓度的增加，愈伤组织的平均生长量基本上呈下降趋势.当Kan质量浓度大于6 mg·L－1时，Kan对第2次继代处理愈伤组织平均生长的抑制作用明显大于第1次继代愈伤组织的生长(图1).随着Kan质量浓度的增加，其对愈伤组织生长抑制的强度，在不同基因型和不同继代次数间存在明显差异.

不同质量浓度的Kan处理后对愈伤组织分化再生能力具有明显的影响，随着Kan质量浓度的增加，愈伤组织的分化再生率呈明显下降趋势(图2).但是，不同基因型和不同继代处理次数的愈伤组织，对Kan敏感性存在较大差异，基因型郑22×P2对Kan的敏感程度高于基因型齐319×87－1，Kan继代1次对愈伤组织分化再生的影响程度明显小于继代2次的愈伤组织.

综上所述，遗传转化中利用Kan筛选转化体时，选用的质量浓度不宜大于6 mg·L－1，且愈伤组织的筛选继代次数不宜过多.

2.2 G418对愈伤组织生长和分化的影响

对生长在含有不同质量浓度G418培养基中愈伤组织的平均生长量，进行了差异显著性比较，结果列于表1.从表1中可以看出，培养基中添加G418后，愈伤组织的平均生长量显著低于对照，并且，随着培养基中G418质量浓度的增加，87－1和87－1×郑22 2个基因型愈伤组织的平均生长量呈显著或极显著的下降趋势.在相同的质量浓度下，G418对2种基因型愈伤组织平均生长量的影响无明显差异.

G418对愈伤组织的生长质量也存在明显影响，在不含有G418培养基中生长的愈伤组织，颜色鲜黄，富有光泽，组织块呈颗粒状，具有典型的胚性愈伤组织结构.在低质量浓度G418培养基中的愈伤组织，颜色暗黄，出现褐化现象，组织块颗粒状不明显;随着G418质量浓度的增加，愈伤组织的褐化程度加重，并呈水渍状，胚性愈性组织明显减少，当G418质量浓度大于45 mg·L－1时，愈伤组织褐化率均在70%以上(表2).G418对不同基因型愈伤组织生长质量的影响存在较大差异，在含有不同质量浓度G418培养基中87－1愈伤组织的褐化率均高于87－1×郑22的褐化率.

从表2可以看出，愈伤组织分化的结果.在含有G418培养基中愈伤组织的分化再生能力明显低于对照，G418的质量浓度大于55 mg·L－1时，继代后的愈伤组织就完全褐化或呈水渍状，失去了分化能力;G418的质量浓度大于25 mg·L－1时，愈伤组织失去了产生再生苗的能力.G418对不同基因型愈伤组织分化再生能力的影响存在明显差异，87－1×郑22愈伤组织的分化再生能力高于87－1.

表1 不同质量浓度G418处理愈伤组织平均生长量差异显著性比较Table 1 Difference comparison of growth amount with various concentration of G418 on 87－1

2.3 抑菌剂Cef对愈伤组织生长及分化的影响

采用方差分析方法，对不同Cef质量浓度下愈伤组织的生长量，进行了差异显著性分析，采用t测验方法，对不同继代次数间和不同基因型间愈伤组织的平均生长量，进行了差异显著性分析，结果列于表3.从表3可以看出，基因型87－1×齐319用不同质量浓度的Cef进行第1次继代处理后，仅有400 mg·L－1质量浓度下愈伤组织的平均生长量低于对照，其它处理间愈伤组织的平均生长量均无明显差异;第2次继代处理后，100～400 mg·L－1处理的愈伤组织平均生长量与对照无显著差异，而在500，600 mg·L－1质量浓度下愈伤组织的平均生长量明显低于对照.基因型昌7－2×HiIIA的愈伤组织，用不同质量浓度的Cef两次继代处理后，仅有100 mg·L－1质量浓度中愈伤组织的平均生长量与对照无显著差异，而其它处理的愈伤组织平均生长量都小于对照.

表2 不同质量浓度G418继代后愈伤组织分化结果Table 2 The differentiated result of calli with different G418 concentration treatment

Cef对不同继代次数愈伤组织平均生长量的影响，在2个基因型间存在差异.对照在第1次继代后愈伤组织平均生长量均高于第2次继代后愈伤组织生长量.培养中添加不同质量浓度的Cef后，基因型87－1×齐319愈伤组织平均生长量，在不同继代次数间均无显著差异;而在Cef质量浓度为300～600 mg·L－1时，基因型昌7－2×HiIIA 第1次继代培养的愈伤组织平均生长量，高于第2次继代培养的愈伤组织平均生长量，并且，在此情况下二者之间的差值明显大于在对照情况下的差值.所以，从2个基因型不同质量浓度间愈伤组织平均生长量的差异显著性可以看出，基因型昌7－2×HiIIA的愈伤组织对Cef的敏感性高于87－1×齐319.

以上分析说明，在低质量浓度时，Cef对愈伤组织的生长无显著影响，随着质量浓度的增加Cef对愈伤组织的生长开始具有抑制作用，当质量浓度大于500 mg·L－1时，Cef对愈伤组织生长的抑制作用显著加大，随着继代次数的增加，Cef对愈伤组织生长的抑制作用具有一定的累加效应.但是，不同基因型的愈伤组织对Cef敏感性具有差异.

表3 Cef对愈伤组织生长量影响的差异显著性分析Table 3 Difference comparison of growth amount with different Cef concentration treatment

Cef对愈伤组织分化再生能力影响:当Cef质量浓度为600 mg·L－1时，基因型87－1×齐319愈伤组织的分化出苗率明显高于对照.在培养基中添加Cef后，基因型昌7－2×HiIIA第1次继代培养的愈伤组织分化出苗率均高于对照.而87－1×齐319第1次不同质量浓度Cef继代培养的愈伤组织和昌7－2×HiIIA第2次不同质量浓度Cef继代培养的愈伤组织的分化出苗率与对照均无显著差异.87－1×齐319仅在400 mg·L－1时，愈伤组织的分化出苗率在不同继代次数间呈显著差异.2个基因型的愈伤组织经不同质量浓度Cef处理后，其分化出苗率在2个基因型间差异不显著(表4).

表4 Cef对愈伤组织分化出苗影响的差异显著性分析Table 4 Difference comparison of regeneration with different Cef concentration treatment

3 结论与讨论

遗传转化研究中常以抗生素筛选转化材料，尤其在植物转化中的应用更为广泛，但在试验中会经常出现筛选结果不准确的现象［5］.所以，在以抗生素作为筛选标记的基因转化中，确定适宜的筛选压力是提高基因转化率的前提［6］.Kan，G418等是玉米遗传转化研究中常用的抗性筛选剂，研究其对愈伤组织生长及分化出苗的影响，对于有效筛选转化体和提高转化效率具有重要意义.

本研究结果表明，低质量浓度的Kan对愈伤组织的生长影响不大，但随着Kan质量浓度的提高及继代次数的增加，逐渐开始对生长产生抑制作用，愈伤组织的平均生长量逐渐减小，但没有明显致死作用，这与前人研究的结果相似［7，8］.而 Kan对愈伤组织的分化影响很大，较低质量浓度已严重影响了出苗率，6 mg·L－1已经很少有绿苗出现，完全白化苗数量增多.根据Kan对愈伤组织生长和分化再生能力的影响，初步确定用Kan进行处理时，6 mg·L－1的Kan质量浓度是玉米愈伤组织的敏感浓度.

通常是以愈伤组织块的褐化现象作为愈伤组织死亡的标准，但在遗传转化过程中 ，许多转化体是由褐化的愈伤组织块再生而来的.仅凭愈伤组织的颜色变化来定性其为死亡，有欠妥当，而在愈伤组织的分化和生根上，则比较易于判断［9］.抗生素筛选的最终目的是得到转基因苗，所以结合抗生素对出苗状况的影响确定合适的质量浓度更为合理.一定质量浓度的G418对玉米愈伤组织的生长和分化影响都极为明显.G418能导致愈伤组织很快褐化，出苗率下降.经G418处理的愈伤组织在分化过程中继续起作用，愈伤组织进一步褐化，说明G418对愈伤组织的毒害作用具有一定的滞后效应.综合试验结果，初步认为15 mg·L－1是愈伤组织对G418的敏感质量浓度.由于不同基因型的愈伤组织对G418的反应存在差异，所以在进行遗传转化时，应对所用的材料进行敏感性测定，以确定适宜的筛选质量浓度.

用农杆菌介导法对玉米愈伤组织进行基因转化时，需要在培养基中加入抑菌剂及时有效地杀死或抑制农杆菌，同时不能对愈伤组织生长与分化产生太大的影响，因此，如何选择抑菌剂及其使用剂量是转化成功的一个重要因素.氨苄青霉素(Amp)、羧苄青霉素(Carb)和头孢霉素(Cef)是根瘤农杆菌介导的遗传转化中广泛使用的杀菌剂，它们能以较低的副作用来抑制细菌细胞壁的合成［10］.这3种抗生素对大多数菌株具有较好的杀菌效果，许多学者认为Cef抑菌效果好，负作用也较小.Cef对农杆菌 LBA4404有较好的抑制作用［11］，Cef质量浓度为 200 mg·L－1时，对薰衣草的愈伤组织诱导几乎没有影响，同时又具有很好的抑菌效果［12］.Cef质量浓度达到 500 mg·L－1时对棉花切段启动和愈伤组织生长有影响［13，14］.由于不同材料对抗菌素的反应存在差异，所以转化前确定抗菌素的使用量，将有利于玉米遗传转化工作的进展.本研究表明，Cef对玉米愈伤组织分化再生能力具有一定的促进作用，尤其当质量浓度大于500 mg·L－1时，其促进作用更为明显.其他研究者也得出了相似的结果［15，16］.这可能是由在培养基中加入Cef后，起到了一定的干燥作用，因为在试验过程中观察到，含有不同质量浓度Cef培养的愈伤组织水份含量明显低于对照，并且Cef质量浓度越大，干燥程度就越高.有研究表明，玉米愈伤组织经过干燥处理后，可显著提高其分化出苗率［17］.但是，当Cef质量浓度大于100 mg·L－1时，其对愈伤组织的生长具有显著抑制作用，且随着Cef质量浓度上升，其抑制强度呈增加趋势.Cef对愈伤组织生长的抑制作用在2个基因型间存在差异.所以，作者认为在玉米遗传转化研究中，应根据所用材料及农杆菌菌株的种类在100～200 mg·L－1范围内筛选适宜的Cef使用质量浓度较为恰当.

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