玉米基因组DNA快速提取方法

吴向远，丁 冬，宋桂良，付志远

(河南农业大学农学院，河南 郑州 450002)

基因克隆、种子纯度检验、分子标记辅助选择育种等目标的实现都离不开分子标记技术的发展［1～4］，而分子标记的广泛应用要以高效、快速的基因组DNA 提取为前提和保证.在植物基因组DNA 提取方法中，SDS和CTAB［5］是2种经典有效的方法，能够得到大量的高质量DNA，但其提取步骤复杂、耗时。随后产生了用切除的部分胚乳通过NaOH 裂解法提取基因组DNA，该方法虽然能够达到批量样品基因组DNA快速提取且保持种子活力的目的，但得到的DNA 无法长期保存［6］.为解决这一问题，本研究以玉米回交世代群体单粒种子胚乳和单株叶片为材料，以十二烷基肌氨酸钠(SLS)，Tris-HCl，EDTA(乙二胺四乙酸)和NaCl为主要试剂，结合电钻和液氮研磨，分析了其提取效果，并探讨了其在玉米种子纯度检验和分子标记辅助育种应用中的可行性.

1 材料与方法

1.1 试验材料

以杂交种郑单958 及其亲本自交系郑58和昌7-2为种子纯度检验材料，以3000株(综3×许178)× 许178的BC1分离群体为分子标记分析材料.

1.2 试验方法

1.2.1 单粒种子胚乳DNA 提取 选取96 粒干种子，超纯水浸泡20 min.

2)用手术刀片轻轻剥开种皮，剥取微量胚乳放入PCR 板中.

3)加入100μL NaOH 溶液(0.2 mol·L-1，pH值=8.0)，盖上与PCR 板对应的硅胶垫，放入PCR仪中，100℃温育15 min.

4)取出PCR 板后，加入等体积TE 溶液(pH值=2.0)并吸取上清液，冷却10 min.

5)用质量分数0.8%琼脂糖电泳检测或直接用于PCR 扩增;不用时用保鲜膜密封于4℃冰箱保存(不能超过14 d).

1.2.2 单叶片DNA 提取

1)取微量玉米叶片于2.0 mL的离心管中，用系有细绳的小夹子夹住离心管管盖，放入液氮缸中速冻5 s.

2)迅速从液氮缸中提出离心管，用插有玻璃棒的电钻将离心管中冷冻的叶片迅速研磨成粉末(速度要快，以防降解).

3)加入800μL 质量分数1%SLS 提取液(100 g·L-1SLS，0.2 mol·L-1EDTA，1 mol·L-1NaCl，1 mol·L-1Tris-HCl)，充分混匀(2～5 min).

4)加入1 mL的V(苯酚)∶V(氯仿)∶V(异戊醇)=25∶24∶1，充分混匀(2～5 min).

5)10000 r·min-1离心5 min，取上清液于1个新的2 mL 离心管中.

(6)向上清液中加入与上清液等体积预冷的异丙醇，沉淀DNA.

(7)10000 r·min-1离心5 min，弃上清液，并用体积分数75%乙醇洗涤DNA.

(8)DNA 干燥后用灭菌水溶解.

(9)在质量分数0.8%琼脂糖电泳检测或直接用于PCR 扩增.

1.2.3 PCR 反应体系和反应程序 反应总体积15μL，包括10×PCR Buffer(含20 mol·L-1Mg2+)1.5μL，NTPs(2.5 mmol·L-1)0.3μL，Taq 酶(5 U·μL-1)0.1μL，引物(50 mg·L-1)1.5μL，DNA(20 mg·L-1)3.0μL，ddH2O 8.6μL.反应液混合后，用20μL的石蜡油覆盖，以防反应液蒸发.PCR 扩增程序为PCR 反应在PTC-200PCR 反应仪上进行.

PCR 反应程序为:95℃预变性2 min，95℃变性1 min，65℃(-1℃/cycle)退火1 min，72℃延伸1.5 min共7个循环;95℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共28个循环;72℃延伸10 min，待温度降至4℃时取出.扩增产物用质量分数6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染程序参考李晓辉等［8］的方法.

2 结果与分析

2.1 DNA 样品凝胶电泳检测

基因组DNA 提取后，在NanoDrop Spectrophotometer ND-1000 核酸测定仪上测定DNA 质量浓度.2种方法提取的样品DNA的A260/A280比值均为1.8～2.0，在260 nm 处的吸收峰曲线稳定，粗提的DNA 得率在250～400 mg·L-1.在琼脂糖凝胶上对提取的DNA 进行电泳检测，NaOH 裂解法(图1)对玉米单粒种子胚乳的DNA 提取效果较十二烷基肌氨酸钠法对玉米叶片的DNA 提取效果(图2)稍差，杂质较后者多，但2种方法得到的基因组DNA 均有清晰的主带，对普通的SSR 反应都有效.

图1 NaOH 裂解法提取的玉米子粒胚乳DNAFig.1 Electrophoresis map of amplified DNA from maize endosperm

2.2 单粒种子胚乳NaOH 裂解法和改良SLS 法所得DNA 应用的比较

用单粒种子胚乳NaOH 裂解法快速提取玉米杂交种郑单958 及亲本自交系郑58和昌7-2的DNA，并利用自己保存的SSR 引物，选取了在亲本间有遗传多态性的2 对引物phi 116和bnlg 1450对郑单958 杂交种的纯度进行了检测(图3).无论在杂交种中，还是亲本中，2 对引物扩增条带都十分清楚，完全可以达到检验种子纯度的目的.

同理，对采用改良SLS 法提取的(综3× 许178)×许178的BC1回交群体DNA 进行了标记分析，筛选了在综3和许178 间存在多态性的SSR 标记.图4为引物bnlg 1191 对BC1回交群体检测的部分单株DNA分子带型.由图4可见，回交群体个体间的多态性分离明显，目的条带清晰，完全可以实现对特定DNA片段进行扩增的要求.

3 讨论

目前，SSR 标记技术已被用于种质鉴定、种子纯度分析、遗传图谱构建、基因定位及标记辅助选择等研究领域［7～9］.无论是鉴定，还是对分离群体目标性状及时的前期选择，都涉及批量、大规模样本基因组DNA的提取［10，11］.如何高效、快速地提取基因组DNA 已成为分子标记技术应用于玉米育种研究的首要限制因素.本研究为探索解决这一问题的途径，对已有的从玉米单粒种子胚乳中提取DNA的方法［12，13］进行了优化，并提出了从玉米单叶片中快速提取玉米基因组DNA［14］的改良实用方法.与传统CTAB 法和SDS 法相比，本研究所用的2种方法都用电钻粉碎取代了手工研磨，节约了劳动力和成本.尽管SLS 比SDS 价格高，但该方法步骤简单，节约了时间，提高了效率，比传统方法的提取效率提高了2～3倍，1 d 内可提取600～800份样品的DNA.与传统方法相比，NaOH 裂解法同样可以达到快速提取基因组DNA的目的.用NaOH 裂解法提取玉米单粒种子胚乳DNA 仅有简单的2 步，1 人·d-1很容易提取1000份，尤其遇到图位克隆中涉及大群体样品DNA 提取时，该方法更为高效、快捷.但与SLS 法相比，该方法提取的基因组DNA 不易于长期保存，也无法用于后续的DNA 纯化和测序工作.尽管2种方法各有优点，但是都可以作为目前最经济、高效、便捷的DNA 提取方法，可以有效满足玉米品种纯度鉴定和分子标记辅助育种的需求.

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