姜黄素对体外培养的人食管癌Ec-109细胞增殖和凋亡的影响

龚 淼，李 莉，包宪霞，孟 丽，张亚楠，郭浅妤，赵 昱，张 雷*

（1.河北医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，河北石家庄 050017；2.石家庄市医学高等专科学校组织学与

胚胎学教研室，河北石家庄 050000；3.河北医科大学基础医学院电镜实验中心，河北石家庄 050017）

·论 著·

姜黄素对体外培养的人食管癌Ec-109细胞增殖和凋亡的影响

龚 淼1，李 莉1，包宪霞2，孟 丽3，张亚楠1，郭浅妤1，赵 昱1，张 雷1*

（1.河北医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，河北石家庄 050017；2.石家庄市医学高等专科学校组织学与

胚胎学教研室，河北石家庄 050000；3.河北医科大学基础医学院电镜实验中心，河北石家庄 050017）

目的研究姜黄素对体外培养的人食管癌（esophageal carcinoma 109，Ec-109）细胞增殖和凋亡的影响。方法采用噻唑兰（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测不同浓度姜黄素对人食管癌Ec-109细胞增殖的影响；流式细胞术检测Ec-109细胞的凋亡情况；免疫细胞化学方法检测Fas、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）蛋白表达的情况。结果姜黄素可显著抑制Ec-109细胞的增殖，呈剂量和时间依赖性，半数抑制浓度（inhibitory concentraltion 50，IC50）为22.09μmol/L（姜黄素浓度为80μmol/L作用60h）。不同浓度姜黄素均可诱导Ec-109细胞凋亡。姜黄素可显著下调Ec-109细胞PCNA蛋白表达，显著上调Fas蛋白表达。结论姜黄素可抑制体外培养的人食管癌Ec-109细胞的增殖，诱导其凋亡。

姜黄素；食管肿瘤；细胞增殖；细胞凋亡

姜黄素是从姜科植物的根茎姜黄中提取的一种植物多酚，具有抗炎、抗氧化、降血脂、抗肿瘤等广泛的药理作用［1］。近年来有研究［2］发现姜黄素在抗消化系统肿瘤中有显著作用，但其对低分化食管癌细胞的作用尚未见报道。本研究拟探讨姜黄素对体外培养的人食管癌（esophageal carcinoma 109，Ec-109）细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和药物：RPMI1640培养基（Gibco公司，美国）；胎牛血清（杭州四季青生物制品公司）；噻唑兰（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）；荧光染料（Sigma公司，美国）；兔抗人Fas抗体、兔抗人增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗体和SP试剂盒（北京中山金桥生物技术有限公司）。姜黄素（Sigma公司，美国），实验前用1mL二甲基亚砜充分溶解，用RPMI1640培养液配成终浓度为80μmol/L的母液，后稀释至所需浓度。

1.1.2 细胞株：人食管癌Ec-109细胞株由中国医学科学院肿瘤研究所建系，本实验室冻存。接种细胞于含15%胎牛血清的RPMI1640完全培养液中，培养瓶放置于37℃、5%CO2、95%空气饱和湿度培养箱中。

1.2 方法

1.2.1 MTT法测定姜黄素对Ec-109细胞增殖的影响：取对数生长期的Ec-109细胞和正常人外周血单个核细胞，接种于96孔培养板中，每孔滴加200μL单细胞悬液，使每孔含量1.4×103个细胞，设8个复孔，同时接种6个96孔板，常规培养16h后，实验组加入终浓度分别为20、40和80μmol/L姜黄素，阴性对照组加入等体积完全培养液，空白对照组只加培养液不加细胞作为比色时调零用。分别在常规培养20、40和60 h后取出2个培养板每孔滴加MTT溶液（5g/L）20μL，37℃培养箱中孵育4h后终止培养。去除孔内上清液，每孔滴加DMSO 200μL，振荡15min。用酶标仪在570nm处测定各孔吸光度（A值），记录结果，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率计算公式，增殖抑制率（%）=（1-实验组A/对照组A）×100%。

1.2.2 流式细胞术测定姜黄素对Ec-109细胞凋亡的影响：取12瓶对数生长期Ec-109细胞，不同浓度（0、20、40和80μmol/L）姜黄素分别作用20、40和60h。每隔20h取出不同药物浓度细胞4瓶，收集细胞分别放入4个离心管内标记后进行离心，制成细胞浓度为1×109个/L的单细胞悬液离心后弃上清液缓慢加入预冷70%无水乙醇7m L，4℃过夜。采用PI单染法，以10%鸡红细胞作内参标准，与样品同步染色，每份样品中加入1mL PI染液，在4℃避光孵育30min。用488nm氩离子激光器激发由带630nm带通滤光片接收，通过散点图收集10 000个细胞，分析PI荧光直方图上凋亡细胞百分率。

1.2.3 免疫细胞化学方法测定Fas、PCNA蛋白的表达：取对数生长期细胞制成浓度为1×108个/L的单细胞悬液，接种到放有盖玻片的6孔板，培养箱孵育24h，使细胞贴壁于盖玻片上。24h后取出6孔板去上清液分别给予药物终浓度为0、20、40、80 μmol/L的姜黄素继续培养20、40和60h后分别取出盖玻片。SP法进行免疫细胞化学染色，3%甲醇-H2O2室温处理10min，微波抗原修复（9℃）15min。免疫细胞化学法染色。用己知阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗做阴性对照。采用图像分析系统进行定量分析，每张玻片随机取5个高倍视野，测定特异性着色的平均积分光密度值来分析相应指标的蛋白表达的水平，平均积分光密度值越高，其表达越高。

1.3 统计学方法：应用SPSS13.0统计学软件进行分析，计量资料以¯x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用SNK检验（q检验）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 姜黄素对Ec-109细胞增殖的影响：MTT结果显示，不同浓度姜黄素对Ec-109细胞有明显生长抑制作用（P＜0.05），当80μmol/L姜黄素处理Ec-109细胞60h后，其增殖抑制率达到85.7%，显示出较强的增殖抑制作用。姜黄素作用20h的半数抑制浓度（inhibitory concentraltion 50，IC50）为113.28μmol/L（P＜0.05），作用40h的IC50为13.28 mg/L（P＜0.05），作用60h的IC50为8.13mg/L（P＜0.05）。细胞增殖抑制率随姜黄素浓度的升高和作用时间的延长而逐渐升高，具有浓度的时间依赖性。见表1。

表1 姜黄素对Ec-109细胞增殖抑制率的影响Table 1 Effects of Curcum in on the proliferation of Ec-109 cells

2.2 姜黄素对Ec-109细胞凋亡的影响：流式细胞术结果显示，不同浓度姜黄素溶液对Ec-109细胞有明显的凋亡诱导作用，细胞凋亡率随姜黄素浓度的升高和作用时间的延长而逐渐升高，具有浓度和时间依赖性（P＜0.05），见表2。

表2 姜黄素对Ec-109细胞凋亡率的影响Table 2 Effect of curcum in on the apoptosis of Ec-109 cells

图1 PCNA在阴性对照组Ec-109细胞中的阳性表达（免疫细胞化学法×200）Figure 1 Positive expression of PCNA in Ec-109 cells of negative control group（immunocytochemistry×200）

图2 PCNA在经80μmol/L姜黄素作用40h后的Ec-109细胞中的弱阳性表达（免疫细胞化学法×200）Figure 2 Weak positive expression of PCNA in Ec-109 cells treated with 80μmol/L curcumin for 40h（immunocytochemistry×200）

2.3 姜黄素对Ec-109细胞Fas、PCNA蛋白表达的影响：Fas蛋白阳性表达部位为细胞膜，PCNA蛋白阳性表达部位为细胞核。免疫细胞化学结果显示，PCNA蛋白在姜黄素作用组表达明显下调，在阴性对照组呈强阳性表达，Fas蛋白在姜黄素作用组表达明显上调，在阴性对照组呈阴性表达，见表3、4，图1～4。

表3 姜黄素对Ec-109细胞PCNA蛋白表达的影响Table 3 Effects of curcum in on the expression of PCNA protein in Ec-109 cells for 20h、40h、60h by ICC

表4 姜黄素对Ec-109细胞Fas蛋白表达的影响Table4 Effects of curcum in on the expression of Fas protein in Ec-109 cells for 20h、40h、60h by ICC

图3 Fas在阴性对照组Ec-109细胞中的阴性表达（免疫细胞化学法×200）Figure 3 Negative expression of Fas in Ec-109 cells of negative control group（immunocytochemistry×200）

图4 Fas在经80μmol/L姜黄素作用40h后的Ec-109细胞中的阳性表达（免疫细胞化学法×200）Figure 4 Positive expression of Fas in Ec-109 cells treated with 80μmol/L curcumin for 40h（immunocytochemistry×200）

3 讨 论

本实验研究了姜黄素对人食管癌Ec-109细胞株的增殖抑制和凋亡诱导作用。肿瘤细胞区别于正常细胞的一个重要特征就是肿瘤细胞可以持续分裂并不断增殖［3］。本实验结果显示姜黄素对Ec-109细胞增殖有显著的抑制作用，并呈剂量与时间依赖性，随着作用时间的延长，80μmol/L浓度姜黄素组对Ec-109细胞的生长抑制作用大于20μmol/L浓度组，姜黄素溶液在80μmol/L浓度下作用60h对细胞的抑制增殖作用最明显，IC50为8.13mg/L。

细胞凋亡是指由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序诱导的细胞死亡过程［4］。凋亡细胞的DNA分子发生断裂，分子量小的DNA片段穿过细胞膜丢失，分子量大的片段形成一个DNA含量小于二倍体的区域，在流式细胞仪检测中形成位于G0/G1峰之前的亚G1峰，由于坏死的细胞检测不出现此峰，故此峰被称作凋亡峰［5］，凋亡峰的高度和宽度与凋亡细胞的数量成正比，本研究结果显示，姜黄素可以诱导Ec-109细胞凋亡，并有量效和时效依赖关系，此结果与前面MTT和流式细胞仪分别检测细胞的增殖能力和细胞周期相一致。

综上所述，姜黄素可抑制体外培养的人食管癌Ec-109细胞的增殖，诱导其凋亡。

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（本文编辑：刘斯静）

EFFECTSOF CURCUM IN ON THE PROLIFERATION AND APOPTOSISOF HUMAN ESOPHAGEAL CARCINOMA Ec-109 CELLS IN VITRO

GONG Miao1，LILi1，BAO Xianxia2，MENG Li3，ZHANG Yanan1，GUO Qianyu1，ZHAO Yu1，ZHANG Lei1*
（1.Department of Histology and Embryology，the School of Basic Medical Sciences，HebeiMedical University，Shijiazhuang 050017，China；2.Department of Histology and Embryology，Shijiazhuang Medical College，
Shijiazhuang 050000，China；3.Laboratory Center of Electron Microscopy，the School of Basic Medical Sciences，HebeiMedical University，Shijiazhuang 050017，China）

ObjectiveTo observe the effects of curcumin on the proliferation and apoptosis of human esophageal carcinoma 109（Ec-109）cell line in vitro.MethodsThe inhibitory effect of curcumin on the proliferation of human Ec-109 cells at different concentrations was determined by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay.The changes of cellapoptosis rate of tumor cellswere determined by flow cytometry（FCM）.The expressions of Fas and proliferating cell nuclear antigen（PCNA）proteins were examined by immunocytochemical technique.ResultsCurcumin significantly inhibited the proliferation of Ec-109 cells in a dose-and time-dependentmanner，with the inhibitory concentraltion 50（IC50）of22.09μmol/L（Curcumin concentration for 80μmol/L role of 60h）.Different concentrations of curcumin can induce apoptosis of Ec-109 cell.Curcumin dramatically inhibited protein expression of PCNA，while upregulated the expression of Fas protein.ConclusionCurcumin can inhibit theproliferation of Ec-109 cells and induce the apoptosis of Ec-109 cells in vitro.

curcumin；esophageal neoplasms；cell proliferation；apoptosis

R329.28

A

1007-3205（2012）02-0125-04

2011-12-05；

2012-01-27

河北省科技厅计划指导课题（10276181）

龚淼（1983-），女，河北石家庄人，河北医科大学基础医学院助教，医学学士，从事组织学与胚胎学研究。

*通讯作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.02.001