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神经干细胞-施万细胞-聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架移植对脊髓损伤大鼠的影响①

2012-05-08夏雷郝淑煜李德志陈刚高川川历俊华万虹

中国康复理论与实践 2012年5期
关键词:轴突脊髓干细胞

夏雷,郝淑煜,李德志,陈刚,高川川,历俊华,万虹

·基础研究·

神经干细胞-施万细胞-聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架移植对脊髓损伤大鼠的影响①

夏雷1,郝淑煜2,李德志2,陈刚3,高川川1,历俊华4,万虹4

目的探讨种植神经干细胞(NSCs)与施万细胞(SCs)的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)支架移植促进脊髓损伤大鼠神经功能恢复的作用及机制。方法体外培养NSCs和SCs,以PLGA为支架移植入大鼠T8半横断脊髓损伤处。实验动物随机分为PLGA组、PLGA+NSCs组和PLGA+NSCs+SCs组。术前和术后进行皮层运动诱发电位(CMEPs)检查及BBB评分;然后在同侧或对侧进行T6再次半横断,并进行CMEPs检测及BBB评分。结果CMEPs的恢复率及波幅在PLGA+NSCs+SCs组最高。移植后,大鼠BBB评分逐渐改善;在移植后第2周及以后,PLGA+NSCs组和PLGA+NSCs+SCs组的BBB评分显著高于PLGA组(P<0.001)。同侧再次半横断后,CMEPs消失,BBB评分快速恢复;对侧再次半横断后,大鼠双下肢完全瘫痪。结论种植NSCs和SCs的PLGA支架移植有利于脊髓损伤功能重建,再生轴突可能形成了功能性连接;但是同侧再生轴突对脊髓功能的恢复作用有限。

脊髓损伤;组织工程;神经干细胞;施万细胞;聚乳酸-羟基乙酸共聚物;支架

[本文著录格式]夏雷,郝淑煜,李德志,等.神经干细胞-施万细胞-聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架移植对脊髓损伤大鼠的影响[J].中国康复理论与实践,2012,18(5):417-419.

组织工程技术结合生物材料、细胞或组织、生物活性分子、组织微环境的刺激机械力[1],一些包含细胞外基质、细胞、多聚物或支架的[2-4]工程化物质已经显示出支持再生和功能恢复的潜力。神经干细胞(neural stem cells,NSCs)和施万细胞(Schwann cells,SCs)被认为是促生长细胞,长期以来一直被用于脊髓损伤的研究[5-8]。我们设计了一种新型PLGA取向支架,具有多个纵向平行排列的微管(直径200~300μm),微管壁上有直径10~20μm的孔隙,使微管之间能互相沟通,以利于分子交换,在其中种入NSCs和SCs,使移植细胞在取向支架内有序排列[9-11]。本研究将细胞-支架组织工程复合物移植到大鼠脊髓半横断损伤处,分析大鼠神经功能恢复情况及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器 孕14~16 d和新生1~3 d W istar大鼠,购自中国医学科学院动物研究所。健康雌性W istar大鼠,体重250~300 g,共105只,术后最终存活并完成实验63只。实验大鼠随机分为3组:①PLGA组(n=30):脊髓半横断后移植含DMEM培养液的PLGA支架;②PLGA+NSCs组(n=30):脊髓半横断后移植种植了NSCs的PLGA支架;③PLGA+NSCs+ SCs组(n=45):脊髓半横断后移植种植了NSCs、SCs的PLGA支架。神经术中电生理监测仪:美国AXON公司。

[11-13]构建GFP-HIV载体转染NSCs。

PLGA取向支架由中国科学院化学研究所王身国教授提供,经环氧乙烷气体灭菌后储存备用。

参考文献[12]体外培养NSCs和SCs并鉴定。

参考文献[2,9,14]制作大鼠脊髓T8半横断损伤模型。

1.2 PLGA-NSCs-SCs复合体的构建 PLGA取向支架4×1.5×1.2mm,浸入DMEM/F12液中。用微量移液器吸取5µl细胞悬液,含5×105NSCs和5×105SCs (PLGA+NSCs+SCs组)或1×106NSCs(PLGA+NSCs组)垂直滴于PLGA支架顶端,将支架置于滤纸上,使细胞悬液完全吸入支架[15]。将支架置于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中2 h,植入横断处。

1.3 电生理检查 术前和术后第1、24周时进行皮层运动诱发电位(corticalmotor evoked potentials,CMEPs)检查。第25周取PLGA+NSCs+SCs组3只大鼠进行同侧T6半横断,再次行CMEPs检测。

于前囟后方2mm,矢状缝外侧2mm(感觉运动皮层)钻一直径1.2 mm的骨孔,直达硬膜。以直径1.2 mm不锈钢螺旋电极钻入骨孔,深度1mm,为刺激电极;参考电极为针状电极,插入鼻尖后方5mm头皮中线上;另一针状电极插入尾根部,作为地线;感应电极为一对针状电极,插入胫前肌。刺激强度10 V,至少重复2次。

1.4 运动功能 采用Basso-Beattle-Bresnahan(BBB)评分进行后肢运动功能评分。移植前1周,实验大鼠进行两次BBB评分,使其适应测试和测试环境。于移植后1、2、3、4、8、12和24周在固定、较开放的环境中对实验大鼠活动录像,由2位不了解治疗分组的观察者独立对大鼠后肢运动功能进行评分,每个时间点观察3次,每次4 m in。第25周取PLGA+NSCs+SCs组3只大鼠进行同侧T6半横断,3只对侧T6半横断,再次行BBB评分,每周1次,共2周。

2 结果

2.1 CMEPs 术后1周,各组大鼠的CMEPs均消失。术后24周,大鼠CMEPs有不同程度的恢复。CMEPs恢复率和CMEPs波幅在PLGA+NSCs+SCs组最高(P<0.05)。CMEPs潜伏期在各组之间无显著性差异。见表1。同侧再次半横断后,CMEPs消失。

表1 CM EPs恢复情况

2.2 BBB评分 移植后24周内,大鼠后肢运动功能逐渐改善。第2周及以后,PLGA+NSCs组和PLGA+ NSCs+SCs组的评分显著高于PLGA组(P<0.001)。但PLGA+NSCs组和PLGA+NSCs+SCs组的BBB评分在各时间点都没有显著性差异。见表2。

表2 各组BBB评分的比较

同侧再次半横断后,大鼠麻醉苏醒后(大约术后2 h)BBB评分达到(1.33±0.33),2周后达到(11.67± 0.33)。对侧再次半横断后,大鼠出现双下肢完全瘫痪(BBB评分为0),并持续1周,第2周达到(0.67± 0.33)。见表3。

表3 不同侧别再次半横断后BBB评分比较

3 讨论

三维取向支架为支持移植细胞的存活和轴突再生提供了一个平台。我们以前的实验显示,在体内外,PLGA支架与NSCs和SCs有良好的亲和性和相容性[16-17];PLGA支架移植后,脊髓组织缺损减少,支架中血管形成[18]。

移植术后第24周,一些大鼠的CMEPs有不同程度恢复;同侧再次半横断后,恢复的CMEPs消失。提示CMEPs由同侧再生轴突传导,并形成了功能性连接。我们以前的实验显示,联合NSCs和SCs有利于轴突再生和髓鞘化[2]。这一结果与本实验的电生理评价一致。

CMEPs的恢复率及平均波幅在PLGA+NSCs+SCs组最高,提示有更多的轴突再生,并形成功能性连接。NSCs和SCs被认为是促生长细胞,长期以来一直被用于脊髓损伤的研究[5-8,19]。SCs能分泌多种神经营养因子、细胞黏附分子和细胞外基质,还有形成髓鞘的能力[20]。而NSCs促生长能力一般归因于神经营养因子的连续分泌[21]。有人认为,一些来源于NSCs的星形胶质细胞(一般认为它们阻碍轴突再生)有利于再生。NSCs来源的星形细胞表型还不成熟,这些细胞可能对神经椎的生长起支持作用[22]。还有研究发现,波形蛋白阳性的星形细胞与再生轴突关系密切,这些细胞可能通过接触介导机制对轴突起引导作用[23]。

为了明确再生对功能恢复的作用,我们进行了同侧或对侧再损伤实验。同侧再次半横断并未完全破坏同侧下肢的运动功能,但是对侧再次半横断导致双侧下肢的完全瘫痪。提示再生轴突对同侧功能的恢复作用有限。这可能也是为什么电生理评价PLGA+NSCs+ SCs组恢复良好,但BBB评分却不够理想的原因。

再生轴突对功能恢复的作用有限可能是由于再生轴突的数量较少。我们以前的实验结果显示,大部分NSCs迁移到邻近脊髓区域并死亡[9-10]。因此,支架中NSCs数量不足,不能产生显著的NSCs诱导的细胞接触介导的轴突再生(NSCs-induced cell-contact-mediated axonal regeneration),而后者对轴突再生起作用[22]。

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Effect of Com p lex of Neural Stem Cells,Schwann Cells,and Poly(Lactic-co-glycolic Acid)Scaffolds Transp lant on Spinal Cord Injured Rats

XIA Lei,HAO Shu-yu,LIDe-zhi,etal.Beijing Sanbo Brain Hospital,CapitalMedical University,Beijing 100093,China

Ob jectiveTo explore the effect of transplanting poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA)scaffolds seeded with neural stem cells(NSCs)and Schwann cells(SCs)on spinal cord injured rats and themechanism.M ethodsNSCs and SCs were cultured in vitro and then seeded into the directional PLGA scaffolds.Then PLGA-cell complexes were implanted into the spinal cord hem isected rats,which were divided into PLGA group,PLGA+NSCs group and PLGA+NSC+SCs group.The ratswere tested with corticalmotor evoked potentials(CMEPs)and Basso-Beattle-Bresnahan(BBB)score.Then,the ratswere further ipsilaterally or contralateral hem isected at T6and tested with CMEPs and BBB score again.Resu ltsThe incidence of recovery and the amplitudes of CMEPswere the highest in PLGA+NSCs+ SCs group.The rats exhibited a gradual improvement in hindlimb locomotor function in score.The BBB score was the least in the PLGA group in the 2nd week or later.A fter retransected ipsilaterally,the CMEPs disappeared again and the BBB score improved quickly.Butafter retransected contralaterally,the ratswere completely paraplegia.ConclusionThe directional PLGA scaffolds seeded with NSCs and SCs facilitate the recovery in spinal cord injured rats,whichmay associatewith axonal regeneration and functional connections,but play a lim ited role.

spinal cord injury;tissue engineering;neuralstem cells;Schwann cells;poly(lactic-co-glycolic acid);scaffold

R651.2

A

1006-9771(2012)05-0417-03

2012-02-20

2012-03-28)

国家自然科学基金国际合作研究资助项目(30540450581)。

1.北京三博脑科医院,首都医科大学第十一临床学院,北京市100093;2.首都医科大学附属北京天坛医院,北京市100050;3.无锡市第四人民医院神经外科,江苏无锡市214062;4.首都医科大学附属北京市神经外科研究所,北京市100050。作者简介:夏雷(1978-),男,湖南益阳市人,博士,主治医师,主要研究方向:中枢神经系统损伤修复。通讯作者:万虹。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.05.006

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