高效液相色谱法检测非洛地平缓释片中的氧化产物

吕治红,贺丽娟,霍建富

(山西康宝生物制品股份有限公司，山西 长治 046011)

非洛地平为一种二氢吡啶钙通道拮抗剂，通过选择性地扩张动脉阻力血管，产生与剂量有关的血管阻力降低，对心肌收缩力与心率无明显影响，不引起体位性低血压。其制剂非洛地平缓释片，半衰期近24 h，给药方便，降压效果较好且副作用轻微，具有良好的耐受性和顺从性[1]，是国内高血压患者广泛使用的降压药。非洛地平氧化产物4-(2,3-二氯苯基)-2,6-二甲基吡啶-3,5-二羧酸乙基甲基酯是非洛地平缓释片的主要杂质，准确测定其含量对保证该药品的有效性具有重要的意义。作者在此建立了非洛地平缓释片中氧化产物的高效液相色谱检测方法。

1 实验

1.1 试药、试剂与仪器

非洛地平缓释片(规格：2.5 mg/片，批号：101001、101002、101003、100907、100908、100909)，山西康宝生物制品有限公司；氧化产物(H152/37)对照品(批号：1269390)，USP REFERENCE STANDARD。

乙腈、甲醇，色谱级，天津科密欧化学试剂有限公司；磷酸，分析纯，天津凯通化学试剂有限公司；磷酸二氢钠，分析纯，天津北联精细化学品开发有限公司。

AE240型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；LC-10ATvp型高效液相色谱仪、SPd-10Avp型紫外检测仪，日本岛津公司；C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2 系统适用性实验

色谱条件：C18色谱柱，检测波长 254 nm，流动相为pH值3.0的乙腈-甲醇-磷酸盐缓冲溶液(取1 mol·L-1磷酸溶液8.0 mL、1 mol·L-1磷酸二氢钠溶液50.0 mL，用水稀释至1000 mL)(2∶1∶2)，流速1.5 mL·min-1，进样量20 μL。取氧化产物对照品适量，用流动相溶解并定量稀释成3 μg·mL-1的溶液，进样，记录色谱图，进行色谱条件与系统适用性实验。

1.3 供试品溶液的制备

取非洛地平缓释片10片，精密称定，研细；精密称取适量细粉(约相当于非洛地平5 mg)，置50 mL量瓶中，加乙腈20 mL、甲醇10 mL，超声处理5 min；加pH值3.0的磷酸盐缓冲溶液15 mL，超声处理至非洛地平缓释片溶解，放冷，用pH值3.0的磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，经滤膜(0.45 μm)滤过，精密量取续滤液作为供试品溶液。

1.4 标准曲线的绘制

精密称取氧化产物对照品适量，用流动相溶解并制成30.5 μg·mL-1的溶液，作为贮备液；精密量取贮备液0.5 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL分别置于100 mL、10 mL、10 mL、10 mL、10 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，配制成0.1525 μg·mL-1、1.525 μg·mL-1、3.050 μg·mL-1、4.575 μg·mL-1、6.100 μg·mL-1的溶液；按1.2色谱条件分别进样测定，以样品浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.5 检测限与定量限的确定

在1.2色谱条件下，取氧化产物对照品溶液逐级稀释进样。按仪器噪音的10倍响应值测定定量限；按仪器噪音的3倍响应值测定检测限。

1.6 重复性实验

取氧化产物对照品适量，用流动相分别制成2.44 μg·mL-1、3.05 μg·mL-1、3.66 μg·mL-1的对照品溶液，连续进样3次，记录色谱图，计算峰面积的相对标准偏差。

1.7 回收率实验

取适量(约相当于非洛地平5 mg)非洛地平缓释片(批号：101001)细粉9份，置50 mL量瓶中，分别加入乙腈20 mL、甲醇10 mL，超声处理5 min，加pH值3.0的磷酸盐缓冲溶液10 mL，超声处理30 min，使非洛地平溶解，放冷。再分别加入氧化产物对照品贮备液(30.5 μg·mL-1)3 mL、4 mL、5 mL，制成氧化产物低、中、高三个浓度的供试液各3份。用pH值3.0的磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，经滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液进样测定，计算回收率。

1.8 溶液稳定性

取氧化产物对照品适量，用流动相制成3 μg·mL-1的供试液，于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h取样，在1.2色谱条件下进样测定，计算平均峰面积及相对标准偏差(%)。

1.9 样品测定

取6批非洛地平缓释片制得供试品溶液；取氧化产物(H152/37)对照品适量，用流动相溶解并定量稀释成3 μg·mL-1的溶液，作为对照品溶液；精密量取供试品溶液和对照品溶液各20 μL进样测定，记录色谱图。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件与系统适用性

在1.2色谱条件下，理论板数为8101.129、拖尾因子为1.054，基本符合《中国药典》2010年版二部[2]的有关规定。取处方量的空白辅料，进样测定。结果表明辅料对氧化产物测定无干扰。

对非洛地平缓释片(批号：101001)进行酸、碱、加热、氧化和光照的破坏实验，结果非洛地平缓释片在各种破坏条件下均不稳定，但氧化产物与主成分及降解产物的分离度均符合测定要求。综合上述结果，确定1.2色谱条件适于非洛地平缓释片中氧化产物检测。

2.2 标准曲线(图1)

图1 氧化产物(H152/37)标准曲线

由图1拟合得线性回归方程为：y=9687.9x-59.887，R2=0.9999。氧化产物的浓度在0.1525～6.100 μg·mL-1范围内与峰面积线性关系良好。

2.3 检测限与定量限

实验结果表明，氧化产物的检测限为0.61 ng，定量限为1.83 ng。

2.4 重复性(表1)

表1 氧化产物重复性实验结果

由表1可知，3个浓度的相对标准偏差(RSD)均小于1%，说明本方法的重复性较好。

2.5 回收率(表2)

由表2可知，氧化产物平均回收率为98.43%，RSD为0.59%。

2.6 溶液稳定性(表3)

由表3可知，在24 h内溶液稳定性较好，相对标准偏差(RSD)小于1%。

2.7 样品测定结果

供试品溶液的色谱图中， 如出现与对照品溶液相应的氧化产物(H152/37)色谱峰，其含量不得超过非洛地平标示量的3.0%。6批样品氧化产物测定结果见表4。

表2 氧化产物回收率实验结果

表3 氧化产物溶液稳定性实验结果

由表4可知，6批样品氧化产物含量均符合要求。

2.8 讨论

考察了流速对色谱行为的影响，结果见表5。

表4 6批样品氧化产物测定结果

表5 流速对色谱行为的影响

由表5可知，不同流速下的分离度均符合测定要求，但流速为1.5 mL·min-1时，保留时间短。因此，选择流速为1.5 mL·min-1。

3 结论

建立了非洛地平缓释片中氧化产物的高效液相色谱检测法。色谱条件：C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为pH值3.0的乙腈-甲醇-磷酸盐缓冲溶液(2∶1∶2)，检测波长254 nm，流速1.5 mL·min-1，检测浓度3 μg·mL-1，进样量20 μL。氧化产物浓度在0.1525～6.100 μg·mL-1的范围内与峰面积线性关系良好，检测限为0.61 ng，定量限为1.83 ng；重复性实验相对标准偏差(RSD)均小于1%；平均回收率为98.43%。此方法重复性好、稳定性高，适合非洛地平缓释片中氧化产物的测定。

参考文献：

[1] 朱兵成.非洛地平缓释片治疗老年高血压72例临床分析[J].淮海医药,2009,27(1):54-55.

[2] 《中国药典》国家药典委员会.中国药典2010年版(二部)[M].北京：中国医药科技出版社，2010：29-31.