棘白霉素类化合物脱酰基酶产生菌的转化工艺研究

刘 靓,娄 忻,张 莉,关亚鹏

(华北制药集团新药研究开发有限责任公司 微生物药物国家工程研究中心，河北 石家庄 050015)

近年来，棘白霉素类抗真菌药发展迅猛，已有卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净等多个广谱、低毒、高效的新化合物进入了临床研究[1～3]。FR901379为棘白霉素类化合物米卡芬净的前体物质，在合成米卡芬净时需要将其通过脱酰基酶作用脱去酰基后连接其它侧链。

均匀设计的数学原理是数论中的一致分布理论，着重在实验范围内考虑实验点均匀散布以求通过最少的实验来获得最多的信息，因而其实验次数比正交设计明显减少，特别适合于多因素多水平的实验[4，5]。

作者对棘白霉素类化合物脱酰基酶产生菌ZH-020的转化工艺进行研究，确定了最佳转化条件，并通过均匀设计实验优化了其发酵培养基的配方。

1 实验

1.1 菌种

供试菌株为ZH-020。

1.2 培养基

斜面培养基：葡萄糖，酵母粉，麦芽粉，FeSO4·7H2O，ZnSO4，MnCl2，琼脂，蒸馏水配制，pH值7.2。

种子培养基：糊精，蔗糖，酵母粉，磷酸氢二钾，玉米浆，FeSO4·7H2O，蒸馏水配制，pH值7.4。

发酵培养基：花生饼粉，葡萄糖，蔗糖，磷酸二氢钾，无水硫酸镁。

1.3 摇瓶培养

单菌落转接于斜面上，待长出丰满孢子后接入种子培养基中，置于30 ℃、220 r·min-1的摇床培养48 h左右；然后按3%接种量接入发酵培养基中，置于30 ℃、220 r·min-1的摇床培养96 h左右。加入底物，转化一段时间后，采用HPLC法测定最终发酵效价(μg·mL-1),依下式计算转化率：

1.4 转化条件实验

以ZH-020为出发菌株，分别在25 ℃和30 ℃的条件下，向发酵液中加入不同浓度(1000 mg·L-1、1200 mg·L-1、1400 mg·L-1)的底物FR901379，并改变转化时间(20 h、24 h、28 h)，进行转化条件实验，确定最佳转化条件。

1.5 均匀设计实验

设花生饼粉、葡萄糖、蔗糖、磷酸二氢钾、无水硫酸镁5个因素分别为自变量X1、X2、X3、X4、X5，相对转化率为因变量Y1，采用均匀设计实验对ZH-020发酵培养基的配方进行优化。均匀设计实验的因素和水平见表1。

表1 U12(65)均匀设计实验因素和水平/%

2 结果与讨论

2.1 转化条件的确定

转化条件实验结果见表2。

表2 不同转化条件下的实验结果

由表2可知，底物浓度为1000 mg·L-1时，相同温度下转化20 h的转化率较高；随着底物浓度的增大，转化率有所下降；底物浓度增至1200～1400 mg·L-1，延长转化时间至24 h，转化率明显升高；继续延长转化时间至28 h，转化率反而下降。此外，菌株在30 ℃的转化率高于25 ℃的转化率。因此，选择最佳转化条件为：底物浓度1200 mg·L-1、转化时间24 h、转化温度30 ℃，在此条件下，转化率达到73.28%。

2.2 均匀设计实验结果与分析

均匀设计实验结果见表3。

应用均匀设计V4.0版软件进行分析，采用前进法得到相对转化率(Y1)对5个因素花生饼粉(X1)、葡萄糖(X2)、蔗糖(X3)、磷酸二氢钾(X4)、无水硫酸镁(X5)的回归方程(R2=0.9986)为：

表3 U12(65)均匀设计实验结果

由回归方程可见，花生饼粉和无水硫酸镁对相对转化率有较为显著的正交互作用，而蔗糖和无水硫酸镁对相对转化率有较为显著的负交互作用。

回归方程各项参数的方差分析见表4，得到的综合最优解见表5。

表4 回归方程的方差分析

表5 综合最优解

由表4可知，相关系数R2值和P值都很合理，符合统计学要求，说明方程拟合度高，有极其显著的意义。各因素对相对转化率的影响见图1。

图1 各因素对相对转化率的影响

由图1可以看出，葡萄糖对相对转化率产生负影响，无水硫酸镁对相对转化率产生正影响，花生饼粉和蔗糖对相对转化率的影响并不显著，磷酸二氢钾对相对转化率的影响较复杂，有明显最优值出现。

2.3 验证实验

采用表5得到的综合最优解配方(花生饼粉2.5%，葡萄糖1.3%，蔗糖1.0%，磷酸二氢钾0.1%，无水硫酸镁0.05%)进行3批验证实验，结果见表6。

表6 验证实验结果

由表6可知，采用优化发酵培养基配方的转化率较对照提高了33.29%(由于实验中各种因素的影响，比数学模型计算出的综合最优解43.3014%要低一些)。

3 结论

(1)确定了棘白霉素类化合物脱酰基酶产生菌ZH-020的最佳转化条件为：底物浓度1200 mg·L-1、转化时间24 h、转化温度30 ℃。增加底物的添加量，可以更加充分地发挥菌体产酶活性。后续研究可以尝试继续增加底物的添加量，但应注意目的产物与杂质的比率；对于转化时间应精确把握，防止转化的目的产物生成其它杂质。

(2)通过均匀设计实验确定ZH-020的优化发酵培养基配方为：花生饼粉2.5%、葡萄糖1.3%、蔗糖1.0%、磷酸二氢钾0.1%、无水硫酸镁0.05%，采用此配方的转化率比对照提高了33.29%。后续研究还可以通过更多的均匀设计实验更好地掌握碳源、氮源、无机盐等之间的交互关系，进一步优化配方，提高转化率。

参考文献：

[1] 陈由页，曹国颖，傅得兴，等.棘白霉素类抗真菌药的研究进展[J].中国新药杂志，2007,16(14)：1082-1087.

[2] 叶丽娟，朱辉，田敏.微生物来源的真菌细胞壁抑制剂的研究进展[J].国外医药抗生素分册，2005,26(1)：34-41.

[3] 蒋正立，林建群，陈文红.棘白霉素类抗真菌药的研究新进展[J].天津药学，2005，17(5)：62-64.

[4] 方开泰，马长兴.正交与均匀试验设计[M].北京：科学出版社，2001：83-88，153-156.

[5] 刘省伟，赵德.用均匀设计优化达托霉素发酵培养基[J].中国抗生素杂志，2011，36(3)：S4-S7.