低营养产絮菌Rheinheimera aquimaris P6的分离筛选及其絮凝特性研究

刘春爽，赵东风，国亚东，蔡 芸，张云波

(中国石油大学化学化工学院，山东 青岛 266555)

生物絮凝剂作为一种安全、高效、无二次污染、易生物降解的新型药剂，在水处理领域应用前景广阔[1]，但存在生产成本高、用量大的缺点，难以实现规模化应用[2]。因此，分离筛选高效的产絮菌种成为降低生物絮凝剂生产成本的重要途径。

目前，人们已分离筛选出多种产絮菌，如Bacillussp. F19[3]、ProteusmirabilisTJ-1[4]、Bacillusfirmus[5]等均具有较高的产絮能力，所产絮凝剂的絮凝率在90%以上。然而，这些产絮菌的产絮条件大都为富营养条件，如Bacillussp.F19所需底物为20 g·L-1蔗糖、2.5 g·L-1酵母膏；ProteusmirabilisTJ-1所需底物为10 g·L-1葡萄糖、1.0 g·L-1蛋白胨；Bacillusfirmus所需底物为20 g·L-1葡萄糖、5.0 g·L-1蛋白胨，这无形中增加了生物絮凝剂的生产成本。若能分离筛选低营养条件下的高效产絮菌，优化其产絮条件，从源头降低絮凝剂生产成本，对于推动我国生物絮凝剂的工业化应用具有非常重大的理论价值和现实意义。

基于此，作用采用低营养培养基从海洋底泥中分离筛选高效产絮菌株，优化产絮条件，并通过紫外光谱、蛋白和糖显色反应、红外光谱等手段分析低营养条件下所得絮凝剂的组成及结构特征，拟为降低生物絮凝剂的生产成本提供参考。

1 实验

1.1 产絮菌的分离筛选

采用平板划线分离法，以海洋底泥为接种物、以低营养培养基为筛选培养基，经多次纯化后得到高效产絮菌。

低营养培养基：葡萄糖0.5 g·L-1，淀粉0.5 g·L-1，酵母膏0.5 g·L-1，蛋白胨0.5 g·L-1，酪蛋白0.5 g·L-1，K2HPO40.3 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.05 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，pH值7.6。

1.2 生物絮凝剂样品的制备

将制取的生物絮凝剂发酵液在12 000 r·min-1、4 ℃下离心20 min。取上清液浓缩至体积减半，加入3 BV 4 ℃预冷的无水乙醇，振荡至出现白色絮体。常温、5000 r·min-1离心15 min，用无水乙醇洗涤沉淀，溶于少量蒸馏水中，加入3 BV 4 ℃预冷的无水乙醇，振荡后于5000 r·min-1、常温离心15 min，反复2次，将沉淀于40 ℃真空干燥得生物絮凝剂样品。

1.3 絮凝效果的测定

絮凝效果采用高岭土评价方法[6]测定，用絮凝率(μ)表征:

式中：A为空白水样上清液的浊度；B为待测水样上清液的浊度。

1.4 分析检测

生物絮凝剂的紫外光谱分析、蛋白和糖显色反应分析参照文献[7,8]。

生物絮凝剂的红外光谱分析：取1 mg生物絮凝剂样品与150 mg KBr粉末放入玛瑙研钵中在红外灯下轻轻研磨，经压片机压成薄片，上机测定，在500～4000 cm-1扫描。

水中油含量：采用萃取-红外分光光度法(GB/T 16488-1996)[9]测定。

2 结果与讨论

2.1 产絮菌的分离筛选

采用低营养培养基，经过多次稀释平板分离和平板划线纯化，从海洋底泥中筛选出絮凝率在80%以上的菌株7株，其中一株命名为P6的菌株菌落特征为橙黄色、圆形、光滑，发酵液特别粘稠，絮凝效果较好，絮凝率在85%左右。因此，选择此菌株进行进一步实验，研究其发酵产絮特性。该菌为球状，革兰氏阴性，属好氧细菌。经PCR扩增后，将16S rDNA测序结果与Genbank数据库里的序列进行比对，发现与Rheinheimeraaquimaris相似度最高，达99%。因此，P6菌株和其所产絮凝剂被分别命名为RheinheimeraaquimarisP6和 MBF-P6。

2.2 影响Rheinheimera aquimaris P6产絮的关键因素

2.2.1 培养基组成

不同的碳源和氮源对RheinheimeraaquimarisP6产絮能力有不同的影响。分别以葡萄糖、淀粉、蔗糖、柠檬酸三钠、乙酸钠、果糖、乳糖、木糖、乙醇作为碳源，以尿素、NH4Cl、NaNO3、酵母膏、蛋白胨、酪蛋白作为氮源，经相同条件发酵后，测定絮凝率，结果见图1。

图1 不同碳源(a)和氮源(b)对Rheinheimera aquimaris P6产絮效果的影响

由图1可看出，价格低廉的葡萄糖作为碳源、尿素作为氮源时所产絮凝剂的絮凝效果最好。

碳氮比对RheinheimeraaquimarisP6产絮效果的影响见图2。

图2 碳氮比对Rheinheimera aquimaris P6产絮效果的影响

由图2可看出，碳氮比为1∶1时，RheinheimeraaquimarisP6的絮凝率最高，产絮效果最好；碳氮比高于或低于1∶1都会导致絮凝效果变差。由图2还可看出，当碳氮比为5∶1(葡萄糖10 g·L-1,尿素2 g·L-1)时细胞生长最好，但絮凝效果较差。

RheinheimeraaquimarisP6在含有1.5 g·L-1葡萄糖和1.5 g·L-1尿素的培养基中培养48 h后絮凝率达到最高，为87.32%。与现有产絮菌Bacillussp.F19[3]、ProteusmirabilisTJ-1[4]、Bacillusfirmus[5]相比，RheinheimeraaquimarisP6的产絮成本(培养基费用)降低50%～80%。

2.2.2 初始pH值

以1.5 g·L-1葡萄糖作为碳源、1.5 g·L-1尿素作为氮源，调整初始pH值为3～10，考察其对RheinheimeraaquimarisP6产絮效果的影响，结果见图3。

图3 初始pH值对Rheinheimera aquimaris P6产絮效果的影响

由图3可看出，培养基初始pH值为4～9时，发酵液的絮凝率均在85%以上；当pH值为7时，絮凝率达到最高，为89.39%；过低或过高的pH值均对RheinheimeraaquimarisP6产絮有抑制作用。表明RheinheimeraaquimarisP6对环境中pH值要求不严格，易于培养。

2.2.3 金属离子

0.2 g·L-1的Ca2+、Ba2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Al3+、Zn2+、Cu2+对RheinheimeraaquimarisP6产絮效果的影响见图4。

图4 金属离子对Rheinheimera aquimaris P6产絮效果的影响

由图4可看出，不同的金属离子对RheinheimeraaquimarisP6产絮效果的影响不同。Mg2+、Fe2+对菌株RheinheimeraaquimarisP6产絮能力有促进作用，而Mn2+、Zn2+、Cu2+则有明显的抑制作用。这可能是由于，Mg2+是构成细菌体内某些酶的活性成分，并对微生物细胞结构如核糖体、细胞膜等的稳定性起着重要作用，Mg2+的加入有助于促进胞外聚合物中多糖的生成，从而增加絮凝剂产量[10];Fe2+是微生物生长所必需的元素，是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的活性基及铁卟啉的组成部分，Fe2+浓度适宜时，酶合成效果较好，从而使得絮凝剂产量明显增加;而Mn2+、Zn2+、Cu2+是重金属，对微生物具有毒害作用，抑制絮凝剂的产生。

2.2.4 最佳产絮效果

在1.5 g·L-1葡萄糖为碳源、1.5 g·L-1尿素为氮源、培养基初始pH值为7、投加0.2 g·L-1Fe2+的最佳培养条件下，RheinheimeraaquimarisP6所产絮凝剂的絮凝率达到90.2%。可见RheinheimeraaquimarisP6是一株产絮性能稳定的高效产絮菌株。

2.3 生物絮凝剂的组成及结构特征

提取RheinheimeraaquimarisP6发酵液粗产品，在200～600 nm范围内进行紫外扫描。结果表明，紫外扫描曲线在260 nm处无吸收峰,但在280 nm和200 nm处有吸收峰，这说明絮凝剂中几乎不含核酸，但含有蛋白质和糖类。因此可以定性判断该絮凝剂的有效成分是蛋白质和糖类。

经茚三酮、蒽酮等显色剂进行生化反应分析，进一步确定RheinheimeraaquimarisP6所产絮凝剂中含有蛋白质和多糖。

生物絮凝剂样品的红外光谱见图5。

图5 Rheinheimera aquimaris P6所产生物絮凝剂的红外光谱

由图5可看出，3414.46 cm-1处宽而强的特征吸收峰是由O-H键的伸缩振动引起的，可知该絮凝剂结构中必然含有大量的-OH；2960.87 cm-1和2930.73 cm-1处的2个吸收峰是由饱和C-H键的伸缩振动引起的，并且同时存在-CH3和-CH2-；1700～1600 cm-1间的强吸收峰是由C=O键伸缩振动引起的；1000 cm-1附近出现的强吸收峰是由C-O键伸缩振动引起的，由此可判定该絮凝剂结构中存在-COOH；1026.09 cm-1和1069.82 cm-1处出现2个吸收峰，判断还存在另外一种C-O键，应为C-O-C中的C-O键伸缩振动引起的。因此，可以确定RheinheimeraaquimarisP6所产絮凝剂的活性成分中含有多糖物质。

用考马斯亮兰、蒽酮法测定发酵液粗产品中多糖和蛋白质含量。结果表明，RheinheimeraaquimarisP6所产絮凝剂含47.9%蛋白质、47.3%糖，约为1∶1。

3 结论

(1)利用低营养培养基从海洋底泥中筛选到一株高效产絮菌株P6，经16S rDNA鉴定其为Rheinheimeraaquimaris菌属。

(2)RheinheimeraaquimarisP6 产絮最适碳氮源为1.5 g·L-1葡萄糖和1.5 g·L-1尿素，最佳初始发酵pH值为7，在添加0.2 g·L-1Fe2+的条件下，所产絮凝剂的絮凝率达90.2%，与现有产絮菌株相比，絮凝剂生产成本降低50%～80%。

(3)菌株RheinheimeraaquimarisP6所产絮凝剂含有-OH、C-H、C-O和C=O键，由蛋白质和多糖组成，含量分别为47.9%、47.3%，蛋白质和多糖比例约为1∶1。

(4)本研究为从源头降低絮凝剂生产成本、推动我国生物絮凝剂的工业化应用提供了重要的信息。

参考文献：

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