一株高产低温纤维素酶南极细菌的筛选、鉴定及酶学性质初步研究

高 丛,缪锦来,郑 洲,金 青

(1.青岛科技大学化工学院，山东 青岛 266042；2．国家海洋局第一海洋研究所，山东 青岛 266061)

纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，是一种能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系，通常将其分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶，可广泛用于中药成分提取、食品、纺织、饲料、酿酒、石油勘探等诸多领域，尤其在生物能源工业中具有重要地位。利用纤维素酶将废弃纤维类物质糖化，用于制备生物乙醇，缓解能源紧张，是解决未来资源问题的一条重要途径。

目前，人们对常温和高温纤维素酶的研究较多,关于低温纤维素酶的研究相对较少。低温酶既可以实现在低温条件下进行高效酶解反应,同时也可以通过较低温度的热处理使酶失活,从而节约能量,降低生产成本。因此，对低温纤维素酶产生菌的筛选及酶学性质研究已成为热点。

我国关于南极低温纤维素酶的研究才刚刚开始。在南极地区，科研人员已在冰雪、土壤及岩石样品中发现了数量众多的微生物，并证明微生物在南极自然环境下可以产生大量活性物质(如低温酶、抗生素、多糖及脂类等)，为研究低温纤维素酶提供了丰富资源。

作者在此从82株南极细菌中筛选出1株高产低温纤维素酶菌株NJ64，通过16S rDNA序列进行鉴定，并对其产酶条件及酶学性质进行初步研究，以期为南极低温纤维素酶的开发利用奠定基础。

1 实验

1.1 菌株与培养基

南极嗜冷细菌分离于2001年10月～2002年3月在中国第十八次南极科学考察时采集的南极海水水样和海冰样品。

发酵培养基为2216E液体培养基，配方为：蛋白胨5 g、酵母粉1 g；用过滤陈海水定容至1000 mL，pH值7.0～7.5，121 ℃下湿热灭菌20 min。

筛选培养基为添加1%羧甲基纤维素钠的2216E培养基。

1.2 菌株的筛选

采用刚果红染色法[1]在筛选培养基上对82株南极细菌进行初步筛选。

1.3 纤维素酶的活性测定

将菌株于10 ℃摇床培养96 h后，取发酵液在7000 r·min-1的条件下离心15 min，取上清液，过滤，得粗酶液。

以羧甲基纤维素钠为底物，采用DNS法测定纤维素酶活性[2]。在520 nm下用分光光度计测定吸收值。以每分钟每毫升纤维素酶粗酶液水解羧甲基纤维素钠产生1 μg还原糖所需要的酶量定义为1个酶活单位(U)。

1.4 菌株的鉴定

DNA模板的制备[3]：将50 μL菌体培养液加入到100 μL预冷的蒸馏水中，在冰上放置1 h以上或者3次冻融循环(-10 ℃/60 ℃)。

采用细菌16S rDNA的通用引物8-27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) 进行PCR扩增[4]。PCR反应条件为：95 ℃，1 min；55 ℃，1 min；72 ℃，1.5 min；循环30次，72 ℃延伸10 min。PCR产物经纯化后由华大基因上海鼎安生物科技有限公司进行测序。将所测定的细菌的16S rDNA序列同GenBank数据库进行相似性比较分析，选取与实验菌株亲缘关系较近的细菌用BioEdit软件的多序列比对排列(Clustalw multiple alignment)进行序列比对，系统发育分析采用Mega3.1软件的邻接法(Neighbor-joining method)进行。

1.5 菌株产酶条件的研究

分别研究培养时间、初始pH值和培养温度对NJ64产酶的影响。将菌株NJ64接种于发酵培养基中，10 ℃摇床培养120 h，每24 h取发酵液制备粗酶液测定纤维素酶活性；将菌株NJ64分别接种于初始pH值为5.5、6.5、7.5、8.5、9.5及10.5的发酵培养基中，10 ℃摇床培养96 h，测定发酵液中纤维素酶活性；将菌株NJ64接种于发酵培养基中，分别于5 ℃、10 ℃、15 ℃及20 ℃摇床培养96 h，测定发酵液中纤维素酶活性。

1.6 酶学性质初步研究

取10 ℃摇床培养96 h的发酵液，离心后得到粗酶液，分别在0 ℃、10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃及60 ℃的条件下进行酶促反应，40 min后用DNS法测酶活，确定酶促反应最适温度；将粗酶液分别在pH值为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0及11.0的条件下进行酶促反应，40 min后用DNS法测酶活，确定酶促反应最适pH值。

2 结果与讨论

2.1 菌株筛选结果

采用刚果红法从82株南极嗜冷细菌中初筛到7株产纤维素酶的细菌。在平板培养基上进行刚果红染色并脱色后，菌落周围出现明显透明圈。将此7株菌进行复筛，用DNS法测定发酵液的酶活性，比较7株菌产酶活性高低，最终确定菌株NJ64为产酶量最高的细菌。

2.2 菌株NJ64分子生物学鉴定结果

将南极嗜冷菌NJ64的16S rDNA的PCR克隆子进行测序，获得长度为1390 bp的16S rDNA序列，将此16S rDNA序列提交GenBank数据库，获得的序列注册号为：HQ453988。将此序列与GenBank数据库进行比较。结果表明，与菌株NJ64同源性较高的菌株均为假交替单胞菌属(Pseudoalteromonassp.)，其同源性均大于98.5%。16S rDNA序列同源性小于98%，可以认为属于不同的种；同源性小于93%～95%，可以认为属于不同的属[5，6]。因此，通过16S rDNA序列的比较分析，判断菌株NJ64应属于假交替单胞菌属。用BioEdit软件进行序列比对，采用Mega3.1软件的邻接法构建系统发育树，结果见图1。

图1 NJ64系统发育树

由图1可知，系统发育分析与16S rDNA的序列同源性比较结果相一致。菌株NJ64属于交替单胞菌目(Alteromonadales)，交替单胞菌科(Alteromonadaceae)，假交替单胞菌属(Pseudoalteromonassp.)。

2.3 菌株NJ64产酶条件的研究

2.3.1 培养时间对NJ64产酶的影响(图2)

图2 培养时间对NJ64产酶的影响

由图2可知，随着培养时间的延长，纤维素酶活性迅速上升，在72 h时达到最大值，而后酶活性逐渐下降。因此，确定NJ64产酶的最适培养时间为72 h。

2.3.2 初始pH值对NJ64产酶的影响(图3)

图3 初始pH值对NJ64产酶的影响

由图3可知，pH值为7.5时，纤维素酶的活性最高。因此，确定NJ64产酶的最适初始pH值为7.5。

2.3.3 培养温度对NJ64产酶的影响(图4)

图4 培养温度对NJ64产酶的影响

由图4可知，培养温度为5～20 ℃时，纤维素酶活性变化不大；10～15 ℃范围内的酶活性相对较高。因此，确定NJ64产酶的最适培养温度为10 ℃。

2.4 酶学性质初步研究

2.4.1 酶促反应最适温度

反应温度对纤维素酶活性的影响如图5所示。

图5 反应温度对纤维素酶活性的影响

由图5可知，反应温度为10～40 ℃时，纤维素酶具有较高的活性，且酶活性随反应温度的升高变化较为平缓，均保持在较理想水平；反应温度高于40 ℃后，纤维素酶活性急剧下降。因此，可以确定该纤维素酶的最适反应温度为40 ℃，属于低温酶[7]。

2.4.2 酶促反应最适pH值

反应pH值对纤维素酶活性的影响如图6所示。

图6 反应pH值对纤维素酶活性的影响

由图6可知，pH值为6.0～9.0时，随pH值的增大，纤维素酶活性逐渐升高；pH值大于9.0后，酶活性急剧下降。因此，可以确定该纤维素酶的最适反应pH值为9.0左右。

3 结论

从82株南极嗜冷菌中筛选分离出1株高产低温纤维素酶的南极细菌NJ64，经16S rDNA鉴定属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonassp.)；其在初始pH值7.5、10 ℃的环境中发酵培养72 h时产酶量最高；所产纤维素酶的最适酶促反应pH值为9.0左右、最适反应温度为40 ℃，为典型的低温纤维素酶。

目前在利用纤维素酶对废弃纤维素物质进行糖化时，常用的纤维素酶最适酶促反应温度(50 ℃左右)高于酵母的发酵温度(37～40 ℃)[8]，而本实验筛选得到的低温纤维素酶的酶促反应温度与酵母的发酵控制温度范围较为一致，可以将纤维素糖化与发酵同步进行生产乙醇，具有较好的应用前景。

参考文献：

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