豌豆肌动蛋白异型体PEAc3基因的克隆及生物信息学分析

张少斌，王 粲，刘 慧，刘 曦

(沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁 沈阳 110866)

肌动蛋白(Actin)是真核生物中普遍存在的一种古老的蛋白质，是构成细胞骨架的主要成分，也是维持细胞形态结构及生长发育的基础。Actin最早在动物骨骼肌细胞中被发现，我国科学家阎隆飞等[1]首次证明了植物Actin的存在。在细胞中肌动蛋白结合蛋白(Actin binding proteins，ABPs)调控下，Actin微丝的长度、极性、稳定性和三维结构处于动态变化之中，并将Actin纤维与细胞浆和细胞膜的其它成分相连接，从而调节Actin的理化状态，藉以完成多种细胞功能，包括细胞分裂[2]、内吞作用[3]、细胞信号传导[4,5]、重力感应[6,7]、细胞顶端生长[8,9]、细胞器运动[10～12]等。

近年来，人们陆续从高等动植物体中克隆了Actin基因，并分离纯化出许多肌动蛋白异型体。通过对拟南芥Actin基因家族的系统发育分析，将它们分成营养型肌动蛋白(Vegetative actin)和生殖型肌动蛋白(Reproductive actin)，其表达具有明显的组织特异性，并且在大多数组织和器官中往往同时大量表达着两种以上的肌动蛋白异型体[13]，且不同肌动蛋白异型体的表达具有时空的特异性，发挥作用也不尽相同。

作者在此采用RT-PCR技术克隆了豌豆肌动蛋白异型体PEAc3完整编码区的cDNA序列，并作了生物信息学分析，推断了编码蛋白的结构，拟为进一步研究其结构与其生物学作用之间的联系奠定基础。

1 实验

1.1 材料及主要试剂

豌豆(Pisumsativum.)卷须采自温室培养的豌豆植株；大肠杆菌DH5α、质粒pET-30，实验室保存；克隆载体pGEM-T easy，Promega公司；dNTP、Taq聚合酶、胶回收试剂盒、TRizol，Takara公司；其它试剂均为进口或国产分析纯。

引物合成及测序由上海生工生物技术有限公司完成。

1.2 肌动蛋白基因克隆与测序

总RNA提取采用TRizol法，0.1 g卷须加入1 mL TRizol。参照张少斌等[14]的RT-PCR方法，首先将mRNA反转录合成cDNA。根据NCBI检索到的PEAc3序列，设计引物如下：

上游：GC GAATTC ATGGCAGAATCCGA-AGATAT(EcoRI)；下游：GC GGTACC GAAGCATTTCCTGTGTAC(KpnI)。

反应条件为：95 ℃热变性5 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35个循环，72 ℃下延伸10 min，4 ℃保存。

PCR反应结束后，采用琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。参照DNA胶回收纯化试剂盒说明，将PCR扩增产物的特异性片段进行胶回收，与pGEM-T easy载体连接，转化，经蓝白斑筛选，随机挑取白斑进行PCR和酶切鉴定，鉴定正确的菌株送上海生工生物技术有限公司测序。

1.3 肌动蛋白生物信息学分析

应用DNAMAN 6.0生物学软件查找测序得到的核苷酸序列的开放读码框，将PEAc3基因的核酸序列翻译成氨基酸序列，并进行多序列比对，应用生物信息学软件对氨基酸序列进行结构与功能分析。

2 结果与讨论

2.1 PEAc3的克隆与鉴定

RT-PCR产物的质量是关系到最后能否得到正确序列的关键因素，从豌豆总RNA中通过RT-PCR扩增PEAc3的序列结果见图1A。

A.RT-PCR扩增PEAc3 B.重组载体的PCR鉴定 C.重组载体的双酶切鉴定

由图1A可知，条带清晰，大小在1000 bp左右，与核酸序列数据库登记的大小一致。将扩增产物胶回收后连接到pGEM-T easy克隆载体，构建重组载体pGEM-T-PEAc3，经PCR鉴定(图1B)和酶切鉴定(图1C)正确后，送到上海生工生物技术有限公司测序。

2.2 PEAc3序列同源性分析

经序列测定，应用DNAMAN软件分析核酸序列测序结果，证实为具备完整开放阅读框的肌动蛋白基因，并推测了其氨基酸序列，与Genbank中注册的PEAc3序列相比，只有2个氨基酸的差异，分别是328位的S变为I、349位的A变为S，具体序列如图2所示。

图2 克隆的PEAc3氨基酸序列

肌动蛋白基因家族是一个多基因家族，一般具有多个拷贝，碗豆肌动蛋白基因家族进化关系比较见图3。

图3 豌豆肌动蛋白基因家族进化关系比较

由图3可知，通过RT-PCR克隆出的PEAc3基因(图3中标注为PEAc3 RT-PCR)与Genbank中注册豌豆肌动蛋白家族基因序列比对发现，与PEAc9、PEAc12及PEAc3基因注册序列的亲缘关系较近，这与它们同属于同一类基因家族PEAcⅡ相一致，其中与注册的PEAc3同源性最高，为99%。而因PEAc3基因与PEAc1、PEAc17、PEAc14属于不同的豌豆肌动蛋白异型体类别，相应的进化关系较远。

将PEAc3与在NCBI文库中检索到的100多种植物Actin基因进行序列比对，同源性高达89.07%，而且在位点339和350处都是高度保守的，仅同属豌豆PEAcⅡ类肌动蛋白基因家族的6条注册序列PEAc3(AAB18641和AAB38511)、PEAc9(AAB18642和AAB38512)和PEAc11(AAB18643和AAB38513)在该位点存在差异。

在检索到的Actin氨基酸序列中随机选择8条(包括PEAc3在内，还有绿豆、拟南芥、大麦、大豆、烟草、猕猴桃和三叶草)比较同源性，结果见表1。

表1 PEAc3与其它7种植物Actin基因的氨基酸序列同源性的比较/%

由表1可看出，PEAc3基因与绿豆的肌动蛋白基因亲缘关系较近，这与系统分类学中豌豆与绿豆同属于豆科相一致，但是与大豆亲缘关系则相对较远。其次是与禾本科的大麦亲缘关系相对较近，肌动蛋白在真核生物种内与种间基因存在着不同程度的变异，而且存在大量的肌动蛋白异型体，这使得在分子水平上研究植物界的肌动蛋白基因的进化规律较为困难。

2.3 PEAc3序列指纹图谱分析(图4)

图4 PEAc3序列指纹图谱分析

应用DNAMAN6.0推测长度为1134 bp的PEAc3核酸序列，得到了长度为377的氨基酸序列。经疏水性、SignalP 3.0、ProtParam和ScanProfile程序分析推断，PEAc3分子量为41 668.7 Da，理论等电点为5.31，带正电的氨基酸残基(Arg+Lys)数为38个，带负电的氨基酸残基(Asp+Glu)数为50个。PEAc3是由3组序列指纹图谱(Signature)组成的一组序列模体，没有信号肽部分，以成熟蛋白形式存在，经SOSUI程序分析推测该肌动蛋白为可溶性蛋白。

2.4 PEAc3疏水性分析

疏水性分析结果显示，疏水性最高比值为2.300，亲水性最高比值为2.200(比值浮动范围为4，数值越高表示该特性越强)，应用TMHMM 2.0程序对蛋白内部跨膜区的预测与疏水性结果基本相符。预测蛋白可能的跨膜区有3个或2个，位于氨基酸序列位点137～157、304～322和348～366(N端开始)，但是第二个区域304～322位点间的疏水性不是很强，程序预测也可能是2个跨膜区，位于氨基酸序列位点141～157和348～366。

2.5 讨论

除了ACTINS_1上结合一些小分子，ACTINS_2高度保守的色氨酸也与N端谷氨酸共同作用结合Ca2+、天冬氨酸结合Sr2+，这些结合能力为PEAc3在体内发挥细胞信号转导功能奠定了决定性的基础。同时色氨酸也是荧光素RHO通过范德华力结合的位点，所以推测这也可能是鬼笔环肽法活体标记微丝后不能解聚及无法标记单体肌动蛋白的原因。Ca2+存在下微丝解聚成单体肌动蛋白，荧光素与Ca2+共同竞争色氨酸位点，若荧光素竞争力强，则Ca2+无法再结合，微丝不能解聚；而当Ca2+存在下，ACTIN以单体形式存在，鬼笔环肽标记物也无法再结合。

ACTINS_ACT_LIKE序列中没有发现任何配体的结合位点，它折叠缠绕在三维结构的内部，作为保守的序列指纹图谱很可能起到不可取代的结构支撑作用。有趣的是这段序列是Actin和肌动蛋白结合蛋白共有的序列指纹图谱，其意义目前还无法解释清楚。

PEAc3属于豌豆肌动蛋白家族的Ⅱ类异型体，主要在幼嫩组织中表达。以上只是在Actin结构基础上的功能预测，在具体的时空中如何表达，真正发挥哪些作用还需要对该蛋白及其结合蛋白进一步深入研究。

3 结论

根据NCBI文库中检索到的序列，采用RT-PCR技术克隆了豌豆肌动蛋白异型体PEAc3完整编码区的cDNA序列，基因全长1134 bp，开放阅读框编码377个氨基酸。氨基酸序列分析表明，该基因的编码蛋白PEAc3为可溶性蛋白，分子量41 668.7 Da，没有信号肽部分，呈酸性，PEAc3包括ACTINS_1(编号：PS00406)、ACTINS_ACT_LIKE(编号：PS01132)以及ACTINS_2(编号：PS00432)3组肌动蛋白序列指纹图谱(Signature)。序列同源性分析表明PEAc3与其它上百种植物肌动蛋白同源性高达89.07%。

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