真菌壳聚糖的研究进展

王伟平，陈德容，杜予民

(1.湖北工业大学 发酵工程省部共建教育部重点实验室，湖北 武汉 430068；2.武汉大学资源与环境科学学院，湖北 武汉 430072)

壳聚糖(Chitosan)是甲壳素的部分脱乙酰产物，也天然存在于一些真菌的细胞壁中，是自然界唯一大量存在的碱性多糖，具有阳离子聚电解质性和多功能基团反应性，易于化学修饰，安全无毒，具生物相容性和生物降解性[1，2]，在工业、医学、生物学等领域得到了深入的研究和广泛的应用[3～8]。随着人们对壳聚糖及其衍生物应用研究的逐渐深入，对壳聚糖及其制品的需求大幅度增长。

市售壳聚糖是由甲壳素经强碱热解法脱乙酰制备，而甲壳素利用虾、蟹等的外壳采用化学法生产，这种生产方法原料来源受限制、产品性能不稳定、环境污染严重。因此，人们对采用真菌培养法直接生产壳聚糖进行了系列研究。作者在此综述了国内外真菌壳聚糖的合成机理、菌种选育、发酵工艺优化及提取方法等方面的研究进展。

1 合成机理

壳聚糖在真菌体内的生物合成与其它多糖一样，是一个相当复杂的生物化学过程。Davis 等[9]在研究鲁氏毛霉(Mucorrouxii)合成壳聚糖的机理时发现，该菌中存在着甲壳素合成酶(CS)和甲壳素脱乙酰酶(CDA)，首先通过CS催化细胞中存在的氨基糖核苷酸即尿苷二磷酸-N-乙酰-D-葡糖胺(UDP-GlcNAc)转变成N-乙酰-D-葡糖胺即甲壳素，甲壳素通过CDA脱去乙酰基，形成壳聚糖。此类菌体中不仅存在甲壳素，也存在壳聚糖，真菌壳聚糖由两种酶——CS和CDA纵向作用才能合成，二者缺一不可，CS和CDA的活性强弱决定着壳聚糖合成量的多少，UDP-GlcNAc是甲壳素和壳聚糖合成的共同底物；合成速率不单由菌体内源库大小决定，添加外源物如N-乙基-D-葡糖胺可改变合成速率、自由N-乙酰-D-葡糖胺和蛋白酶能促进合成，该合成必需Mg2+或Mn2+存在，但受多氧菌素D抑制。Gamow等[10]报道，甲壳素最初的脱乙酰作用是在一种特殊的酶促进下，甲壳素链更易和胞外的脱乙酰酶作用。对此，Kafeotzopoulos等[11]认为：甲壳素分子刚形成时，分子间未完全键合，CDA易接近新生甲壳素分子的乙酰基团而起作用；一旦甲壳素结晶成微纤维状，CDA难进入分子内部，故难以脱除乙酰基。CDA对未成熟的刚形成的甲壳素有脱乙酰作用，对已形成的甲壳素(无论是胶质还是粉末)的活性则很低，因此壳聚糖能被散布在细胞表面的甲壳素合成酶在甲壳素链结晶化以前优先合成，细胞壁中壳聚糖和甲壳素的比例由到达细胞表面的CS的多少决定。

Domek等[12]研究表明Mucorracemosus有酵母态和菌丝态两种形态，二者化学成分相似，但菌丝态甲壳素和壳聚糖产量是酵母态的3倍。呈菌丝态时，几丁质和壳聚糖处于丝状真菌细胞壁最内层，临近质膜，呈放射状，是真菌菌丝尖端延长部位的主要组分，几丁质与壳聚糖的生成与真菌菌丝的生长关系密切，丝状真菌生长在菌丝体顶端动态延伸[13]，这被认为是由于合成胞囊的合成酶包含在顶端细胞原生质膜上的细胞壁内所导致的[14]。呈酵母态时，细胞壁化合物在整个细胞壁外均匀分布，导致球体形态。据推测，酵母态细胞原生质膜合成胞囊不像菌丝态受特殊位点的限制。Duran等[15]认为，在酵母态，甲壳素合成酶以不活跃酶原形式均匀存在于原生质膜中，由蛋白酶将受限制的酶原带到胞囊的特殊位点导致甲壳素沉积。因此，可以通过提高菌丝态菌丝体的产量或菌丝体中壳聚糖的产率来实现壳聚糖产量的增长[16]。

2 菌种选育

2.1 菌种筛选

不同菌纲真菌细胞壁多糖的主要成分不一样，具体见表1。

表1 真菌细胞壁多糖的主要成分

由表1可知，接合菌纲真菌是细胞壁含有甲壳素和壳聚糖的典型。其中毛霉目包含种类最多、形态最多样化，代表种为毛霉属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)和犁头霉属(Absidia)。真菌壳聚糖的研究主要集中在这三种菌。也有报道从半知菌纲黑曲霉和青霉菌丝体中提取壳聚糖，但黑曲霉和青霉细胞壁只含甲壳素、不含壳聚糖，所得壳聚糖仍由甲壳素经强碱或酶法[17]脱乙酰得到。

不同真菌壳聚糖的菌产量和产率不同，分子量和脱乙酰度等理化特性差异也很大。Wu等[18]利用酵母膏蛋白胨葡萄糖(YPD)培养基液态发酵比较了黑曲霉(Aspergillusniger)和鲁氏毛霉(Mucorrouxii)产壳聚糖的能力，证实Aspergillusniger不产壳聚糖，Mucorrouxii的壳聚糖产率为12.49%，乙酰化程度为19.5%，结晶度比虾壳壳聚糖低。Amorim等[19]利用YPD培养基液态发酵比较了Mucorracemosus和Cunninghamellaelegans产壳聚糖的能力，发现M.racemosus的壳聚糖产量比C.elegans高40%；培养100 h，菌体干重分别达到25 g·L-1和15 g·L-1，壳聚糖产率分别为3.5%和2.0%，DD分别为51%和80%。Miyoshi等[20]从5株不同种类菌体中筛选壳聚糖生产菌株，发现Absidiacoerulea产率最高，达10.4%，乙酰化程度最低，分子量为100～450 kDa，比化学法壳聚糖的分子量(120～1500 kDa)低。Davoust等[21]利用发酵罐培养对15株Absidia菌进行筛选，发现Absidiarepens壳聚糖产率最高，产量为2.8 g·L-1。Hu等[22]对33株真菌进行筛选，发现Absidiaglauca壳聚糖产率最高，为7.4%，产量最高为0.646 g·L-1，该菌吸附Cu2+能力最强，吸附能力比蟹壳壳聚糖高。Shimahara等[23]利用复合培养基从32株Rhizopus菌株中提取壳聚糖，产量为0.330～0.645 g·L-1。Suntornsuk 等[24]利用大豆和绿豆豆粕培养4株真菌，在大豆豆粕培养基上培养Rhizopusoryzae时壳聚糖产量最高，为4.3 g·(kg大豆豆粕)-1。Tan等[25]对接合菌纲的13株真菌进行筛选，发现Gongronellabutleri壳聚糖产率最高，为7.0%，产量为0.47 g·L-1。

2.2 菌种诱变

由于缺乏好的壳聚糖高产菌株的平板筛选方法，菌种诱变的相关报道不多。Maw等[26]利用紫外诱变Gongronellabutleri、应用酶联免疫反应筛选高产菌，具体是通过筛选出甲壳素脱乙酰酶酶活高的菌株而完成的。高产菌株的壳聚糖产量和甲壳素脱乙酰酶酶活均提高2倍。

3 发酵工艺优化

3.1 固、液态发酵方法比较

Crestini 等[27]利用Lentinusedodes分别进行液态和固态发酵产壳聚糖，液态发酵产量为0.12 g·L-1，DD随着培养时间的延长而增大，为5.5%～12.5%；固态发酵产量为6.18 g·(kg小麦秆培养基)-1，为目前资料显示固态发酵壳聚糖产量最高值，DD随着培养时间的延长基本没有变化，为10.1%～12.5%。Nwe等[28]利用土豆或土豆浸出物为培养基主要成分并添加不同的氮源，分别进行固态和液态发酵Gongronellabutleri产壳聚糖，液态发酵产量为0.6 g·L-1[相当于6 g·(kg发酵培养基)-1]，分子量为(0.7～1.2)×105Da，DD为94%～96%；固态发酵产量为3.7 g·(kg发酵培养基)-1，固态发酵利于产生低分子壳聚糖，分子量为(0.25～0.38)×105Da，DD为92%～96%。Wang等[29，30]分别利用固态发酵和液态发酵培养Absidiacoerulea，均得到5～10 kDa的低分子量壳聚糖，固态发酵所得壳聚糖产量为6.12 g·(kg土豆片培养基)-1，利用YPD培养基液态摇瓶发酵所得壳聚糖产量在0.6 g·L-1左右。

3.2 碳源、氮源

微生物生产壳聚糖要和化学法竞争，必须使用更便宜的碳源、氮源。

Amorim等[31]利用甜甘蔗汁或糖蜜为廉价碳源发酵Syncephalastrumracemosum，氮源为0.3%酵母膏，当添加最佳碳源甜甘蔗汁(30 g蔗糖·L-1)时，摇瓶壳聚糖得率为30 mg·(g蔗糖)-1，5 L发酵罐壳聚糖得率为50 mg·(g蔗糖)-1(即1.5 g·L-1)。Göksungur[32]利用处理和未处理的甜菜糖蜜作碳源摇瓶培养Rhizopusoryzae，发现加未处理甜菜糖蜜、糖浓度40 g·dm-3的壳聚糖产量最高，达0.961 g·L-1；利用未处理的甜菜糖蜜作碳源的合成培养基发酵罐培养，在起始糖浓度为45.37 g·dm-3、通气速度为2.10 vvm、搅拌速度为338.93 r·min-1的条件下，壳聚糖产量最高，为1.1 g·L-1，壳聚糖菌丝体产率均为8%～10%。

McGahren等[33]利用10～400 L的不同发酵容器发酵Absidiacoerulea产壳聚糖，结果表明，葡萄糖、糖蜜等都是好的碳源，培养基需要添加高浓度的胺盐、微量元素和酵母膏，利用氨气流加维持pH值4.5，菌丝体干重最高可达25 g·L-1，菌体为米粒样小球，易收集和过滤。

Chatterjee等[34]利用糖蜜盐、PDB和YPG等不同培养基三角瓶液态发酵Mucorrouxii产壳聚糖，产量分别为0.61 g·L-1、0.51 g·L-1和0.57 g·L-1。Nitar等[35]利用GongronellabutleriUSDB 0201甜土豆片和不同浓度的尿素在26 ℃培养7 d，结果表明，尿素加量为7.2 g·(kg底物)-1、起始pH值为5.5时，菌丝体产量最高，为38 g·(kg底物)-1，壳聚糖产率为10.5 g·(100 g菌丝体)-1，DD为89%；和Arcidiacono等[36]液态发酵研究结果一致。

有机废水也可作为真菌壳聚糖的培养基。Yokoi等[37]研究表明，蒸馏废水是培养Absidiaatrospra和Gongronellabutleri产壳聚糖的良好营养源，甜土豆蒸馏废水培养Gongronellabutleri，壳聚糖产量达0.73 g·L-1。

3.3 添加剂

Jaworska等[16]考察了添加Fe2+、Mn2+、Cu2+、胰蛋白酶和甲壳素对Absidiaorchidis产壳聚糖的影响。结果表明，添加Fe2+、Mn2+利于菌丝体增长，26 ℃培养48 h的壳聚糖产量分别从0.40 g·L-1增长到1.28 g·L-1和1.84 g·L-1；添加Fe2+、Mn2+降低了甲壳素脱乙酰酶的活性，对壳聚糖产率影响不大；添加Cu2+抑制菌体生长；添加胰蛋白酶和甲壳素对Absidiaorchidis产壳聚糖没有影响。有报道表明，培养中加入洋地黄苷，壳聚糖会提高产量3倍，洋地黄苷通过分裂甲壳素合成酶，将甲壳素链分解开，在结晶成微晶体前被脱乙酰酶作用[9]。

Chatterjee等[38]添加植物生长激素如赤霉素、吲哚乙酸、吲哚丁酸和激动素到糖蜜-盐培养基中，可提高Mucorrouxii菌丝体和壳聚糖的产量，分别从12%提高到17.4%、从34%提高到69%，其中添加赤霉素效果最好，1 L培养基中添加3 mg赤霉素可提高壳聚糖产量69%，DD不变，但分子量由于激素的添加增大了50%。Chatterjee等[39]还发现，乳清培养基中添加植物生长激素能促进Rhizopusoryzae产壳聚糖，菌体产量提高19%～32%，但壳聚糖产率增长相对较小(1.7%～14.3%)，其中添加赤霉素时菌体和壳聚糖产量提高最大，1 L乳清培养基中添加0.1 mg·L-1赤霉素可提高壳聚糖产量50%。壳聚糖产量提高的原因可能是添加激素提高了甲壳素脱乙酰酶的活性。Yoshihara等[40]认为培养基中添加5～12 g·L-1D-阿洛酮糖利于Rhizopusoryzae细胞壁中壳聚糖的合成。

3.4 接种量、溶氧

Davoust等[21]在10 L发酵罐中培养Absidiarepens产壳聚糖。结果发现，高产壳聚糖的最好方法是保证真菌快速生长和提高菌丝体产量。菌体的生长速度与发酵时的菌体形态密切相关，对于蓝色犁头霉，接种孢子的数量越多，起始生长速度越快，但菌体会提前达到生长平衡，从而导致最终菌体产率降低。液态发酵搅拌速度太低以及接种浓度过高均会严重影响菌体生长。进一步研究菌体形态对壳聚糖产量的影响发现，利用大的搅拌桨叶轮加快转速时，会形成直径更小、更结实的小球，同时避免浆状体的出现，浆状体的菌体产率比小球产率低。溶氧量在转速200 r·min-1时下降迅速，菌体长成浆状；但转速升至350 r·min-1时，菌体变为2～3 mm小球。浆状和2～3 mm小球均抑制菌体生长，而0.5 mm小球利于菌体生长。在对数期，无论形态如何，菌体中壳聚糖的产率稳定；在稳定期，产率从18%持续提高至23%，即产量2.8 g·L-1。并对分批培养和连续培养进行比较，发现连续培养会由于缺乏新的生长点而导致产率较低。

Wu等[41]研究发现，蓝色犁头霉培养过程中对溶氧的需求很高，且对剪切力的强度敏感。利用改进的有2个通信内网管的改良气升式发酵罐液态培养产生的菌丝体的产量比传统的气泡塔式及600 r·min-1搅拌式发酵罐的高2倍，壳聚糖最高产量为3.16 g·L-1，比300 r·min-1搅拌式发酵罐的产量高55%，是目前资料显示液态发酵壳聚糖产量最高值。

3.5 培养时间

不同生长阶段真菌的几丁质和壳聚糖含量不同，通常对数生长期含量较高[9，23,25,33,42]。对数生长期过后，菌体量仍然继续增长，但壳聚糖量逐渐减少。这可能是由于，壳聚糖由新生成的甲壳素经脱乙酰酶作用而得到，在对数生长期，由于菌体积极生长，游离的壳聚糖相当高；到稳定期后，真菌细胞壁发生了生理学改变，壳聚糖被甲壳素和其它多糖所绑定，与其它细胞壁物质结合得更加牢固，使提取变得困难。因此，对数生长末期的壳聚糖产量最高，尽管稳定期菌丝体产量最高，但获得的壳聚糖较少，应在对数期收获菌丝体，以对数生长末期作为菌种筛选的培养期。Amorim等[19]则认为更多的壳聚糖在对数期早期，由脱乙酰酶作用产生，可能早期甲壳素结晶度不高，因而更易被酶作用。

3.6 pH值

Rane等[43]报道pH值对蓝色犁头霉产壳聚糖及壳聚糖的DD有影响，可能是因为脱乙酰酶在最适合pH值下转化甲壳素为壳聚糖的效果更佳。Kafeotzopoulos等[11]研究发现，Mucorrouxii甲壳素脱乙酰酶作用的最适pH值为4.5，壳聚糖分子量随着pH值的增加而增大，在pH值5.46和5.59时分别为251 kDa和317 kDa。

4 提取方法

与从虾、蟹壳中提取的传统方法相比，用丝状真菌生产壳聚糖分离工艺简便，丝状真菌可利用其自身酶的催化作用得到壳聚糖，只需用稀碱和稀酸简单处理就可以得到纯度相当高的制品，大大简化了提取工艺，降低了生产成本。

Domek等[12]用热NaOH去除Mucorracemosus菌丝体中的蛋白质后，剩下的就是甲壳素和壳聚糖。Synowiecki等[44]利用Mucorrouxii液态发酵产壳聚糖，用2% NaOH提取菌丝体，90 ℃脱蛋白质2 h，10%乙酸60 ℃提取壳聚糖6 h，随后将pH值调到9.0，得到壳聚糖，甲壳素和壳聚糖的产率分别为8.9% 和7.3%。

McGahren等[33]对3种不同提取方法进行了比较，结果发现，强酸利于壳聚糖的提取，但导致壳聚糖水解、粘度降低，培养91 h的菌体产量达23 g·L-1；1% HCl回流15 min,壳聚糖产率最高(达12.5%)、粘度最低(为5.3 cP)、纯度为85%。Niederhofer等[45]认为水洗会洗去低分子壳聚糖，改用乙醇洗涤，利用蓝色犁头霉液态培养，得到重均分子量为4.5×104g·mol-1、数均分子量为1.7×104g·mol-1的壳低聚糖，壳低聚糖产率为2.9%。

Nwe等[46]研究发现选择合适的提取方法对壳聚糖的产量影响很大。利用1 mol·L-1NaOH在45 ℃下提取13 h、0.35 mol·L-1乙酸在95 ℃下提取5 h壳聚糖，菌丝体基质没有破坏，得到的是自由壳聚糖，Gongronellabutleri和Absidiacoerulea的壳聚糖产量分别为2 g·(100 g菌丝体)-1和6.5 g·(100 g菌丝体)-1；而将1 mol·L-1NaOH换作11 mol·L-1NaOH，得到产量8～9 g·(100 g菌丝体)-1的复合壳聚糖，其原因是在强碱的作用下，更多甲壳素脱乙酰变成了壳聚糖。

5 结语

已有的研究表明，根据合成途径代谢调控，通过菌种选育，优化营养成分、培养条件或提取方法，可以进一步提高真菌壳聚糖的产量或产率，从而使真菌发酵法工业化生产壳聚糖成为可能，以替代现有的有生产缺陷的化学生产方法。

参考文献：

[1] Onishi H，Machida Y.Biodegradation and distribution of water-soluble chitosan in mice[J].Biomaterials,1999,20(2):175-182.

[2] Mi F L，Tan Y C，Liang H F，et al.In vivo biocompatibility and degradability of a novel injectable-chitosan-based implant[J].Biomaterials，2002，23(1)：181-191.

[3] 杜予民.甲壳素化学与应用的新进展[J].武汉大学学报(自然科学版)，2000，46(2)：181-186.

[4] Kim I Y，Seo S J，Moon H S，et al.Chitosan and its derivatives for tissue engineering applications[J].Biotechnology Advances,2008，26(1):1-21.

[5] Qin C Q，Du Y M，Xiao L.Moisture retention and antibacterial activity of modified chitosan by hydrogen peroxide[J].Journal of Applied Polymer Science，2002，86(7):1724-1730.

[6] Ai H，Wang F，Yang Q S，et al.Preparation and biological activities of chitosan from the larvae of houseflyMuscadomestica[J].Carbohydrate Polymers,2008,72(3):419-423.

[7] Dutta P K，Tripathi S,Mehrotra G K,et al.Perspectives for chitosan based antimicrobial films in food applications[J].Food Chemistry,2009,114(4):1173-1182.

[8] Jayakumar R,Prabaharan M,Nai S V，et al.Novel chitin and chitosan nanoflbers in biomedical applications[J].Biotechnology Advances,2010,28(1):142-150.

[9] Davis L L，Bartnickl-Gaacia S.Chitosan synthesis by the tandem action of chitin synthetase and chitin deacetylase fromMucorrouxii[J].Biochemistry，1984，23(6):1065-1073.

[10] Gamow R I，Ruiz-Herrera J,Fisher E P.The cell wall ofPhycomyces[M].In：E.Cerda-Olmedo and E.D.Lipson(eds.)，Phycomyces.Cold Spring Harbor Laboratory，NY,1987:223-246.

[11] Kafeotzopoulos D，Martrinou A，Bouriotis V.Bioconversion of c-hitin to chitosan：Purification and characterization of chitin deacetylase fromMucorrouxii[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1993，90(7):2564-2568.

[12] Domek D B,Borgia P T.Changes in th rate of chitin-plus-chitosan synthesis accompany morphogenesis ofMucorracemosus[J].Journal of Bacteriology，1981，146(3):945-951.

[13] Hunsley D,Kay D.Wall structure of theNeurosporahyphal apex：Immunofluorescent localization of wall surface antigens[J].J Gen Microbiol，1976，95(2)：233-248.

[14] Gooday G W,Trinci A J P.Wall structure and biosynthesis in fungi[J].Symp Soc Gen Microbiol,1980,30:207-251.

[15] Duran A,Cabib E,Bowers B.Chitin synthetase distribution on the yeast plasma membrane[J].Science，1979,203(4378):363-365.

[16] Jaworska M M,Konieczna E.The influence of supplemental components in nutrient medium on chitosan formation by the fungusAbsidiaorchidis[J].Appl Microbiol Biotechnol，2001,56(1-2):220-224.

[17] Cai J,Yang J H，Du Y M，et al. Enzymatic preparation of chitosan from the wasteAspergillusnigermycelium of citric acid production plant[J].Carbohydrate Polymers，2006，64(2):151-157.

[18] Wu T,Zivanovic S，Draughon F A,et al.Physicochemical properties and bioactivity of fungal chitin and chitosan[J].J Agric Food Chem，2005，53(10)：3888-3894.

[19] Amorim R V S,Souza W,Fukushima K,et al.Faster chitosans production byMucoraleanstrains in submerged culture[J].Brazilian Journal of Microbiology，2001,32(1):20-23.

[20] Miyoshi H,Shimahara K,Watanabe K,et al.Characterisation of some fungal chitosans[J].Bioscience Biotechnology Biochemistry,1992，56：1901-1905.

[21] Davoust N,Hansson G.Idendifing the condiitons for development of beneficial mycelium morphology for chitosan-producingAbsidiaspp.in submersed cultures[J].Applied Microbiology Biotechnology,1992,36(5):618-620.

[22] Hu K J,Hu J L，Ho K P，et al.Screening of fungi for chitosan producers，and copper adsorption capacity of fungal chitosan and chitosanaceous materials[J].Carbohyd Polym,2004,58(1):45-52.

[23] Shimahara K，Takguchi Y，Kobayashi T,et al.Screening ofMucoraceaestrains suitable for chitosan production[M].In：Skjik-Brsk G，Anthonsen T，Sandford P(eds) Chitin and chitosan Elsevier，London，1989：171-178.

[24] Suntornsuk W,Pochanavanich P,Suntornsuk L.Fungal chitosan production on food processing by-products[J].Process Biochem，2002,37(7):727-729.

[25] Tan S C,Tan T K,Wong S M,et al.The chitosan yield ofZygomycetesat their optimum harvesting time[J].Carbohydrate Polymers，1996，30(4)：239-242.

[26] Maw T,Tan T K，Khor E,et al.Selection ofGongronellabutleristrains for enhanced chitosan yield with UV mutagenesis[J].Journal of Biotechnology，2002，95(2):189-193.

[27] Crestini C,Kovac B，Giovannozzi-Sermanni G.Production and isolation of chitosan by submerged and solid-state fermentation fromLentinusedodes[J].Biotechnology and Bioengineering，1996,50(2):207-210.

[28] Nwe N，Chandrkrachang S，Stevens W F，et al.Production of fungal chitosan by solid state and submerged fermentation[J].Carbohydr Polym,2002,49(2)：235-237.

[29] Wang W P,Du Y M，Qiu Y L，et al.A new green technology for direct production of low molecular weight chitosan[J].Carbohydrate Polymers,2008,74(1):127-132.

[30] Wang W P，Du Y M，Wang X Y.Physical properties of fungal chitosan[J].World J Microbiol Biotechnol，2008,24(11):2717-2720.

[31] Amorim R V S,Ledingham W M,Kennedy J F,et al.Chitosan fromSyncephalastrumracemosumusing sugar cane substrates as inexpensive carborn sources[J].Food Biotechnology,2006,20(1):43-53.

[32] Göksungur Y.Optimization of the production of chitosan from beet molasses by response surface methodology[J].Journal of Chemical Technology & Biotechnology，2004，79(9):974-981.

[33] McGahren W J，Perkinson G A,Growich G A，et al.Chitosan by fermentation[J].Process Biochemistry，1984，19(3):88-90.

[34] Chatterjee S，Adhya M，Guha A K，et al.Chitosan fromMucorrouxii：Production and physico-chemical characterization[J].Process Biochem，2005，40(1):395-400.

[35] Nitar N，Willem F.Effect of urea on fungal chitosan production in solid substrate fermentation[J].Process Biochemistry，2004，39(1):1639-1642.

[36] Arcidiacono S，Kaplan D L.Molecular weight distribution of chitosan isolated fromMucorrouxiiunder different culture and processing conditions[J].Biotechnol Bioeng 1992,39(2):281-286.

[37] Yokoi H,Aratake T,Nishio S,et al.Chitosan production from shochu distillery wastewater by funguses[J].Journal of Fermentation and Bioengineering，1998,85(2):246-249.

[38] Chatterjee Sandipan，Chatterjee Sudipta，Chatterjee B P，et al.Influence of plant growth hormones on the growth ofMucorrouxiiand chitosan production[J].Microbiological Research,2009,164(3):347-351.

[39] Chatterjee Sudipta，Chatterjee Sandipan,Chatterjee B P，et al.Enhancement of growth and chitosan production byRhizopusoryzaein whey medium by plant growth hormones[J].International Journal of Biological Macromolecules,2008,42(2):120-126.

[40] Yoshihara K，Shinohara Y，Hirotsu T，et al.Chitosan productivity enhancement inRhizopusoryzaeYPF-61A by D-psicose[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2003，95(3)：293-297.

[41] Wu W T，Huang T K,Wang P M,et al.Cultivation ofAbsidiacoeruleafrom chitosan production in a modified airlift reactor[J].J Chin Inst Chem Engrs,2001，32(3)：235-240.

[42] Muzzarelli R A A，Ilari P，Tarsi P，et al.Chitosan fromAbsidiacoerulea[J].Carbohydr Polym,1994,25(1):45-50.

[43] Rane K D，Hoover D G.Production of chitosan by fungi[J].Food Biotechnology，1993，7(1):11-33.

[44] Synowiecki J，Nadia A A Q.Mycelia ofMucorrouxiias a source of chitin and chitosan[J].Food Chemistry，1997，60(4):605-610.

[45] Niederhofer A N，Müller B W.A method for direct preparation of chitosan with low molecular weight from fungi[J].European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2004，57(1):101-105.

[46] Nwe N,Stevens W F,Montet D,et al.Decomposition of myceliar matrix and extraction of chitosan fromGongronellabutleriUSDB 0201 andAbsidiacoeruleareakATCC 14076[J].International Journal of Biological Macromolecules，2008,43(1)：2-7.