胃癌SGC7901细胞特异性结合肽的筛选及鉴定

郭彩霞 梁晓秋 何晓娟

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率居各类肿瘤的首位。胃癌的早期发现早期治疗尤为重要。1985年美国Missouri大学Smith等［1］创立了噬菌体展示技术。本文应用体内噬菌体展示技术，筛选与人胃癌组织特异性结合的短肽，以指导临床胃癌的早期诊断和靶向治疗，提高药物靶向的特异性，实现治疗的针对性和安全性［2］。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞株:人胃癌细胞株SGC-7901为本室保存。实验动物:BALB/C裸小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司。噬菌体肽库:噬菌体环7肽文库试剂盒 (Ph.D.-C7CTm Phage Display Peptide Library Kit);HRP标记的抗噬菌体单克隆抗体鼠抗M13噬菌体抗体为美国Pharmacia公司产品。M13噬菌体单链DNA快速提取试剂盒为美国QIAGEN公司产品。

1.2 裸鼠体内噬菌体的筛选

尾静脉注射噬菌体随机环7肽文库2×1011pfu/只(将其溶于RPMI-1640溶液中)，15 min后10%水合氯醛麻醉(0.03 ml/10 g)，通过心脏灌注温热的生理盐水20 ml至肝脏完全变白，组织称重后剪碎，加3 ml 0.1%PBST 洗涤组织3 次，3 000 r/min离心10 min，弃去上清。取1 ml大肠杆菌ER2738与组织静止感染30 min后，加入4 ml LB培养液室温孵育30 min，取100μl感染后的菌液测滴度，并计算总产出量。将剩余肿瘤组织感染后的菌液3 000 r/min离心10 min，沉淀全部扩增到10 ml LB，220 r/min，37℃振摇4.5 h，扩增与胃癌组织相结合的噬菌体，4℃下离心纯化，用于下一轮筛选，共4轮。

1.3 酶联免疫吸附法测定噬菌体单克隆对SGC7901的亲和力

按照酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒说明测定噬菌体单克隆对SGC7901的亲和力。

1.4 DNA序列的测定

将ELISA鉴定的噬菌体阳性克隆扩增，试剂盒提取阳性克隆的单链DNA，测序，并根据所测得的碱基序列比对出氨基酸序列。

1.5 结果判定

免疫组化染色按照试剂盒说明书进行操作，结果判定:阳性表达为细胞质呈棕黄色。

2 结果

2.1 噬菌体肽库的胃癌裸鼠体内筛选

15只裸鼠致瘤1～2周后，12只长出瘤状肿块，成瘤率80%。噬菌体环七肽文库尾静脉注射胃癌肿瘤裸鼠，每一轮筛选前均加入相同滴度的噬菌体(2×1011pfu/ml)，筛选后分别测滴度(pfu/m l)。4轮筛选后，从单位肿瘤组织中回收的噬菌体量为单位肝脏组织的88.8倍、单位脑组织的6.7×104倍、单位心脏组织9.7×104倍，可见，经过4轮筛选，噬菌体在胃癌肿瘤组织中得以富集(表1)。

表1 噬菌体肽库胃癌裸鼠体内筛选结果(pfu/g)

2.2 免疫组化测定噬菌体的富集

经过4轮筛选，肿瘤组织结合的噬菌体得到了很好地富集，且区域广泛，见肿瘤细胞胞质、胞膜呈明显棕黄色染色，肝组织中极少数细胞呈浅黄色染色，心脏和脑组织中无黄色染色。

2.3 ELISA鉴定重组噬菌体对SGC7901的亲和力

噬菌体肽库经过4轮体内筛选后，随机挑选13个噬菌体克隆，以噬菌体原库蓝斑作为对照，得出各克隆的OD值，计算各噬菌体克隆对SGC7901的亲和力。当P/N(OD克隆/OD随机对照克隆)＞2.1时，说明此克隆对SGC7901的亲和力强。ELISA结果显示，P/N＞2.1的阳性克隆有12个，P/N＞2.5的阳性克隆有11个，见图1。

图1 ELISA检测第4轮筛选噬菌体克隆与SGC7901的亲和力

2.4 测序结果

12个噬菌体阳性单克隆测序均相同，碱基比对(表2)获得外源性短肽一条，此短肽序列为PPRWMPS，其理论分子量为869.9 Daltons。7个氨基酸中，碱性氨基酸(R)占17.81%;非极性﹑疏水性氨基酸(W，P)占56.19%;极性﹑中性氨基酸(S，M)占25.99%，测序结果见图2。

图2 噬菌体克隆的测序波形图

表2 序列结果读取表

3 讨论

胃癌作为常见的消化道恶性肿瘤发病率逐渐增高，占全世界死亡率的第二位［3］，其在我国恶性肿瘤中的发病率和病死率均居首位［4］。目前，胃癌的治疗方法主要有手术治疗﹑放疗和化疗。近年来胃癌的分子靶向治疗是1种肿瘤细胞过度表达的某些标志性分子作为治疗的靶点，选择性应用阻断剂，干预该靶点的分子调控、信号转导通路，从而达到抑制肿瘤生长、发展的效果［5］。

Newton等应用体内噬菌体展示技术，筛选得到特异性结合前列腺癌噬菌体肽段，并且将筛选的噬菌体荧光标记与小鼠模型体内成像成功［6］。有报道，用津白Ⅱ荷瘤小鼠，体内筛选到乳腺癌特异性结合噬菌体融合肽［7］。陈贻玲等［8］从T7噬菌体文库中筛选到肺癌早期检测分子标志群。Yang等［9］应用改良的噬菌体展示技术(FliTrx细菌肽展示系统)，筛选得到特异性结合高转移性前列腺癌PC-3M-1E8细胞的肽段TMTP1(NVVRQ)，且将TMTP1与FITC结合物注射小鼠体内能有效地检测到转移灶。肿瘤特异性结合肽iRGD(CRGDK/RGPD/EC)与抗癌化学药物结合，使药物有效地作用肿瘤组织，增强抗癌药物的疗效［10］。

实验中为了去除噬菌体文库非特异性结合，我们采用心脏灌注并反复洗涤的方法，最大限度地避免了非特异性结合，保证实验的准确。噬菌体滴度的测定结果显示，经过四轮体内筛选，于对照组织相比，肿瘤组织回收的噬菌体量显著增加，说明此噬菌体与胃癌肿瘤组织特异性结合。噬菌体回收量以及组织免疫组化结果显示，噬菌体在胃癌组织得到了很好的富集，送测的13个噬菌体单克隆中，测序结果表明有12个序列完全一致，即PPRWMPS出现的次数最多，提示此短肽可能对胃癌裸鼠模型的肿瘤组织具有很强的结合力，有望成为胃癌治疗的靶点，为我们下一步研究此短肽与药物的偶联以获得新的胃癌靶向化疗药物做好准备。

［1］ Smith G P.Filamentous fusion phage:novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface〔J〕.Science，1985，228(4705):1315.

［2］ Hortobagyi GN.Opportunities and challenges in the development of targeted therapies〔J〕.Semin Oncol，2004，31(1Suppl 3):21.

［3］ Simona C，Elena G，Virna C，et al.Research activation of HER family members in gastric carcinoma cells mediates resistance to MET inhibition〔J〕.Mol Cancer，2010，121(9):2.

［4］ 杨海平，张才全.胃癌基因治疗的研究进展〔J〕.现代肿瘤医学，2008，16(6):1058.

［5］ 韩淑梅，马廷行，刘桂芬，等.胃癌的分子靶向治疗研究进展〔J〕.山东医药，2006，46(36):83.

［6］ Newton J，Deutscher SL.Phage peptide display〔J〕.Handb Exp Pharmacol，2008，185(2):145.

［7］ 王 瑞，张 霖，张宏恺，等.津白Ⅱ小鼠体内筛选乳腺癌特异性结合噬菌体融合肽〔J〕.天津医科大学学报，2008，14(2):138.

［8］ 陈贻玲，马传亮，赵晋峰，等.T7噬菌体展示文库筛选肺癌早期检测分子标志群〔J〕.实用癌症杂志，2009，24(3):227.

［9］ Yang W，Luo D，Wang S，et al.TMTP1，a novel tumor-homing peptide specifically targetingmetastasis〔J〕.Clin Cancer Res，2008，14(17):494.

［10］ Sugahara K N，Teesalu T，Karmali PP，et al.Tissue-penetrating delivery of compounds and nanoparticles into tumors〔J〕.Cancer Cell，2009，16(6):510.