基于变性梯度凝胶电泳的青县苹果再植障碍园与丰产园土壤细菌多样性研究

张一 王凤忠 杜秉海 靳志刚 李妍 韩明渠 周波 毛志泉

摘要：为了分析比较青县苹果再植障碍园与丰产园的土壤细菌多样性，利用Quantity One软件对变性梯度凝胶电泳(DGGE)图谱进行多样性分析，并对DGGE图谱上的条带切胶测序，以分析群落结构。结果表明，图谱各泳带中的条带数目相差不大，但其亮度有一定差异；DGGE图谱的峰图中，代表丰产园土壤样品的峰具有较大的峰面积；再植障碍园与丰产园土壤中的主要菌群都属于γ变形菌亚门(γ-Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、α变形菌亚门(α-Proteobacteria)；仅存在于再植障碍园样品中的细菌属于厚壁菌门(Firmicutes)、γ变形菌亚门(γ-Proteobacteria)、放线(Actinobacteria)。可见，环渤海湾苹果产区丰产园土壤中的细菌群落与再植障碍园相比拥有较高的丰富度，两种果园有着相似的细菌群落多样性，造成两种果园细菌群落结构差异的细菌具有多样性。

关键词：DGGE技术；土壤细菌多样性；再植障碍

中图分类号：S154.38⁺1(222)文献标识号：A文章编号：1001-4942(2012)01-0071-04

果树再植障碍(Replant problem)是指果园刨除老树后重茬栽种新树时新植树根系发育不良、幼树生长缓慢、植株矮小、抗性降低、甚至整株死亡的现象，这种障碍表现在苹果树上尤为严重。

前人研究结果表明，导致再植障碍的原因多源于土壤，主要与果树根系生长的土壤理化性质、土壤生物环境的变化以及化感作用有关。同时对再植障碍的发生机理做出了一些合理的解释，并提出了多种可行的应对措施。近几年，有关土壤中微生物群落结构变化的研究越来越受到研究者的关注。

果园土壤是一个微生物种类和数量丰富，受人为因素影响较大的复杂的特殊环境。微生物作为物质循环和能量流动的重要参与者，对环境因子的变化非常敏感，在果园土壤生态系统中起着特别重要的作用。因此，研究果园土壤中微生物的群落结构并分析环境因子对此结构的影响，对于了解微生物与这个特殊生态系统的相互关系有很大的帮助，对于研究再植障碍的发生机理有着重要的指导意义。

以往对微生物的研究多建立在传统的富集、分离、培养基础上，而在环境样品中，能用现有技术培养的微生物仅占微生物总种群数的0.01％～10％，难以客观揭示环境中的微生物多样性。分子生物技术的应用克服了传统方法的限制，可以从基因水平上估计种的丰度和均度、查明种的变异情况等，从而可以更客观地认识环境中微生物的群落组成。基于16S rDNA的微生物多样性快速监测已成为现代微生物生态学研究的重要手段，其中DGGE(denaturing gradient gel elec-trophoresis)技术是根据DNA在不同浓度变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化的原理，将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开，从而对微生物群落进行评价的一种较先进的分子生态学方法。由于其具有快速简便、分辨率高、重复性好等优点，目前已广泛应用于各种微生物群落多样性研究中。

河北青县位于中纬度季风区，有显著的大陆性季风气候特征：一是季风显著；二是冬寒夏热，四季分明，春秋短促，气温年变差大；三是雨季很短，集中在夏季，7、8两月降水量占全年的64％～68％，春季少雨，降水量的年际变化也很大。青县是我国苹果主要栽植区，但大片果园开始老化，需进行更新，由于土地资源有限，苹果再植普遍存在。

本试验以青县苹果再植障碍园与丰产园定位取得的样品为研究对象，研究了青县苹果园土壤的细菌群落在不同土层的结构特点及春、夏、秋三季的多样性变化，并针对两类果园土壤样品中细菌群落的特点，从多样性、群落构成这两方面进行了探讨，力图发现丰产园与再植障碍园土壤中细菌群落结构的差异性，为苹果再植障碍发生机理的研究和防治提供科学依据。

1.材料与方法

1.1主要试剂和仪器

E.Z.N.A.Soil DNA Kit和PCR产物纯化试剂盒购自美国OMEGA公司；Taq DNA聚合酶、dNTP及相关试剂购自大连宝生物工程公司；所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；基因扫描由上海生工生物工程有限公司完成。

DGGE仪，美国Bio-Rad公司；T-GradientPCR仪，德国Biometra公司；GelDoc-It凝胶成像系统，美国UVP公司；5810R型离心机(冷冻型)，德国Eppendorf公司。

1.2土壤样品的采集及理化指标的测定

分别于2009年4月28日～5月1日(春季，样品标记为sp)、7月26日～28日(夏季，样品标记为su)、10月9日～11日(秋季，样品标记为au)共3次在河北青县苹果园采集土壤样品。设置再植障碍园(标记为1)与丰产园(标记为2)两个取样点，同一取样点选取0～20cm(标记为a)、20～40cm(标记为b)两个深度，每个深度重复采样3次，土壤样品混匀后于0℃保存。

1.3土壤样品总DNA的提取

样品基因组总DNA的提取、纯化使用E，Z.N.A.Soil DNA Kit(OMEGA，USA)进行。

1.4 DGGE分析

1.4PCR产物的扩增及定量DGGE使用的上游引物为GC-357F(5'-CGCCCGC-CGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGCGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3')，下游引物为517R(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')。反应体系为：DNA模板20ng，上下游引物各10pmol，TaqDNA聚合酶2.5U，dNTP(10mmol/L)1μl，10×PCR buffer(不含MgCl₂)5μl，MgCl₂3μl，ddH20补足至50μl。PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性1min，56℃复性1min，72℃30s，25个循环；72℃延伸10min，4℃保温。PCR产物用浓度为0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测，并用PCR产物纯化试剂盒纯化。

将纯化后的PCR产物利用分光光度计测量260nm与280nm下的吸光值，以测定每微升产物中的DNA含量，并精确吸取含有2000ng DNA的PCR产物，-20℃储存待用。

1.4.2电泳严格按照Bio-Rad的DGGE说明手册步骤操作。

1.4.3连接测序 使用灭菌后的手术刀片将DGGE胶片上的条带切下，并按顺序编号。切下的凝胶置于20μl无菌ddH₂O中，4℃静置12h后12000 r/min离心1min，得到的上清液即为目的条带的DNA。

以离心后的上清液为模板，使用上游引物357F(5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3')和下游

引物517R(5'-ATFACCGCGGCTGCTGG-3')进行扩增。扩增体系及程序与1.4.1中相同。

将上述扩增产物与pMD18-T Vector连接，送样测序。

2.结果与分析

2.1青县苹果再植障碍园与丰产园土壤样品的细菌群落的DGGE图谱

从图1可以看出，1～12号泳带中条带数目相差不大，说明两种果园土壤中的细菌群落拥有相似的多样性。其中e、f、h、i、a、j、k、m出现在所有样品中，代表土壤中的土著细菌群落；L、b、c、d仅出现在再植障碍园的样品中。

2.2 DGGE峰图分析

DGGE直观图谱中直接反应的信息量较少，所以采用Quantity one对图1中所示各泳道条带数目和亮度进行对比分析，其结果如图2所示。可以看出，所有样品的峰主要集中于Rf0.3～0.6和Rf0.9～1.0的区域中，这两个区域的峰拥有较大的峰面积，说明这些峰代表的细菌是环渤海湾苹果产区果园土壤中的主要细菌类群。丰产园土壤样品的峰图拥有较大的峰面积，这说明丰产园土壤中的细菌群落拥有较高的丰富度。

2.3 DGGE图谱中主要条带的定性分析

对DGGE图谱中的主要条带进行定性分析，结果显示存在于所有样品中的条带e、f、i、k、m代表的细菌类群属于放线菌门(Actinobacteria)，h代表的细菌类群属于α变形菌门(α-Proteobac-teria)，a、j代表的细菌类群属于γ-变形菌亚门(γ-Proteobacteria)；仅存在于再植障碍园样品中的条带L、c代表的细菌类群属于放线菌门(Acti-nobacteria)，b代表的细菌类群属于厚壁菌门(Fir-micutes)，d代表的细菌类群属于γ-变形菌亚门(γ-Proteobacteria)。

3.讨论与结论

DGGE是一种快速、可靠的检测土壤微生物群落结构的指纹图谱技术。本研究利用该技术对环渤海湾苹果产区再植障碍园与丰产园土壤样品的细菌群落组成进行对比研究，揭示了此地区苹果园土壤中细菌组成的多态性。

本试验通过直观分析和峰图对比发现，环渤海湾苹果产区丰产园土壤中的细菌群落与再植障碍园相比拥有较高的丰富度；两类果园土壤中的细菌群落拥有相似的多样性；再植障碍园与丰产园土壤中的主要菌群都属于厚壁菌门(Firmi-cutes)、γ变形菌门(γ-Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、α变形菌门(α-Proteobacte-ria)；仅存在于再植障碍园样品中的细菌属于厚壁菌门(Firmicutes)、γ变形菌门(γ-Proteobacte-ria)、放线菌门(Actinobacteria)。此结果指出了环渤海湾苹果产区果园土壤中的主要菌群，同时也说明了造成两种果园细菌群落结构差异的细菌所具有的多样性。