转Bt基因玉米叶片中Bt蛋白的表达和分泌研究

田晓燕 赵蕾 孙红炜 李凡 赵辉 颜世磊 路兴波

摘要：以转Bt玉米Mon810及其亲本非转基因玉米为研究对象，通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)定量检测Mon810玉米叶中Bt蛋白表达量和叶表Bt蛋白分泌量，结果表明叶组织和叶表均可检测到Bt蛋白，组织内Bt蛋白量从苗期到抽丝期随着植株营养生长的加快呈上升趋势，至抽丝期达到顶峰，之后逐渐降低；叶表Bt蛋白分泌量变化无明显规律性。

关键词：酶联免疫吸附测定法(ELISA)；转基因玉米；Bt蛋白

中图分类号：Q783文献标识号：A文章编号：1001-4942(2012)01-0011-03

玉米螟(Pyrausta nubilalus)是我国玉米的主要虫害之一，可危害玉米植株地上的各个部位，使受害部位丧失功能，降低籽粒产量，广泛分布在北京、东北、河北、山东、广西、四川等地，近年来危害日趋严重。

1990年美国Monsanto公司用基因枪法获得了能正常结实的转基因抗虫玉米，使玉米自身能够合成杀虫物质，防治目标害虫。种植转基因抗虫玉米可以减少化学杀虫剂的用量和提高玉米产量，是防治玉米螟危害的有效手段之一，但是其对生态环境潜在的不利影响也不能忽视。国内外学者研究发现，转Bt玉米的根系能够向土壤中分泌CrylAb毒蛋白，而且该毒蛋白能很快与土壤基质结合，较之游离态更难被生物降解，对土壤微生物和生态造成影响。另外，有报道称转基因玉米花粉在一定的浓度下可以使黑凤蝶存活率明显下降，也有一些室内及田间试验结果表明转基因玉米花粉对非目标害虫的存活率无显著影响。本试验在大田环境下对转Bt基因玉米Mon810不同发育时期的Bt蛋白表达量及叶表Bt蛋白分泌量进行测定，旨在为转基因植物的生态安全性评价和有效利用其抗虫特性提供理论参考和依据。

1.材料与方法

1.1供试材料

供试玉米品种为孟山都公司的Mon810(品种为DK647BTY，表达CrylAb杀虫蛋白)及其非转Bt亲本玉米DK647。2010年6月中旬播种，试验田统一施肥和灌水，试验期间不喷施任何农药，其他管理措施同常规大田。在玉米的苗期、拔节期、喇叭口期、抽雄期、抽丝期、乳熟期和完熟期分别按照五点取样法采摘充分伸展开的叶片；Bt-CrylAb酶联免疫试剂盒购自美国Agdia公司。

1.2试验方法

1.2.1叶组织Bt蛋白表达量的测定Bt蛋白的提取：2ml离心管加0.15g经液氮充分研磨的叶组织和1.5ml PBST提取缓冲液；涡旋使之充分混匀，静置30min，离心10min(12000 r/min)，取上清液20μl，用提取液稀释一定的倍数(50倍或100倍)待测。

Bt蛋白的定量测定：按照Bt-CrylAb酶联免疫试剂盒说明的方法进行。加100μl样品提取液于待测样品孔中，保鲜膜覆盖，200r/min振荡15min，于保湿瓷盒中室温孵育2h；用PBST缓冲液洗板，重复5次，之后每个微孔中加100μlCrylAb-enzyme conjugate，保鲜膜覆盖，200 r/min振荡15min，保湿瓷盒中室温孵育2h；去膜，PBST缓冲液冲洗3次，每一个微孔中加100μl的底物，保鲜膜覆盖，室温孵育15min；最后加50μl终止液，充分混匀，30min内用酶标仪测定其450nm处的OD值，根据标准曲线求出Bt蛋白的含量，换算为每克鲜重含有的Bt蛋白量。

1.2.2叶表Bt蛋白分泌量的测定Bt蛋白的提取：先用无菌水将叶面轻轻冲洗3遍，将2.0g叶片和20ml PBST提取液放入锥形瓶中，200 r/min振荡30min，静置10min后取上清20μl，用提取液稀释一定的倍数(50倍或100倍)待测。

Bt蛋白的定量测定：叶表Bt蛋白分泌量的测定方法同上。

1.2.3可溶性蛋白的测定采用考马斯亮兰G250法(Bradford法)测定，以牛血清白蛋白作为标准蛋白，分光光度计测定其OD₅₉₅值。

2.结果与分析

2.1不同生育期Mon810叶片中Bt蛋白表达量分析

对Mon810不同发育阶段Bt蛋白表达量的测定结果(表1)表明，苗期～喇叭口期Bt蛋白表达量呈缓慢上升趋势，不同生育期间无显著差异；喇叭口期～抽丝期，Bt蛋白表达量显著增加，至抽丝期达到最高峰，之后开始下降，完熟期Bt蛋白表达量显著低于抽丝期(P<0.05)。

Bt晶体蛋白占可溶性总蛋白的量在一定程度上反映了不同时期植株Bt基因表达程度的强弱，可视为Bt基因的表达强度。从表1可知，Bt基因的表达强度于拔节期最高，随后开始下降，抽丝期和乳熟期Bt基因的表达强度有所提高，完熟期又有所下降。

2.2不同生育期Mon810叶表Bt蛋白分泌量分析

由表1可知，从苗期到完熟期，Mon810叶面分泌物中均可检测到CrylAb毒蛋白，分泌量在0.20-0.27μg/gFW，占Bt蛋白表达量的1.35％～2.20％，生育期之间无显著差异(P>0.05)。乳熟期和完熟期的Bt分泌量略高于生育前期，叶片的老化可能是导致Bt分泌量增加的主要原因。

3.小结

本试验结果表明，Mon810叶片中的Bt蛋白表达量随着生育期进程而增加，至抽丝期达到最大，之后又开始下降。完熟期的Bt蛋白表达量显著低于抽丝期，可能与株体的老化有关。Bt基因的表达强度在拔节期最高，乳熟期和抽丝期次之，推测表达强度的提高可以提高中后期玉米螟危害最严重时期的抗性。这与李葱葱等的研究结果相似。

国内外许多研究表明，Bt蛋白可与作物的根系分泌物一起被分泌到土壤中，本试验的ELISA检测结果表明，转基因玉米亦可通过叶表分泌专一性Bt蛋白。但分泌量在整个生育期呈现不规律波动，原因可能有二：第一，Bt蛋白作为碳源和氮源被微生物降解利用，因此推测Bt蛋白不会在环境中长期积累；第二，大田试验受很多自然因素的影响，叶表Bt蛋白量的波动可能与采样前的气候，如降雨量等有关。

需要指出的是，我们从阴性对照材料的叶组织内和叶表分泌物中都未检测到Bt蛋白的存在，这说明我们的试验结果是可靠的，可为转基因作物的安全利用提供理论参考。