放射治疗兔耳增生性瘢痕的实验研究

肇阅 张荣明 钟瑞佳 黄超 邢爽 吴存刚

[摘要]目的：研究经过医用高能电子线照射兔耳增生性瘢痕实验模型后，观察伤口愈合的情况、瘢痕愈合后的病理改变及肌动蛋白（ACTIN）和血管生长因子（VEGF）表达变化情况。方法：选用日本大耳白兔18只，在每只兔耳腹侧面制作直径6mm的圆形全层皮肤缺损创面10个。将总计360个缺损创面模型随机分为6组，第1组为空白对照组（3只），其余5组为照射组（各3只）。将照射组每只兔耳随机用200cGy、400cGy、600cGy、800cGy、1000cGy的6Mev电子线照射兔耳缺损创面,照射野周围用铅板防护，观察兔耳缺损创面的愈合情况变化及创面愈合后瘢痕组织进展情况。并于致伤一个月后对实验模型取材，进行光镜、电镜及组织学观察。结果：兔耳腹侧面圆形创面缺损，能产生与人类增生性瘢痕类似的增生块。各照射组，缺损创面愈合延迟。总照射剂量相近的情况下，单次不同照射剂量对增生性瘢痕形成的影响有显著性差异。结论：日本大耳白兔可以形成类似人的增生性瘢痕病理改变，可以用作增生性瘢痕研究的实验动物模型。动物实验证明，医用6Mev高能电子线照射治疗是一种有效的治疗增生性瘫痕的方法，总照射剂量相近的情况下，分5次照射、单次剂量400cGy，为最佳照射剂量。

[关键词]增生性瘢痕；放射治疗；胶原纤维；电子直线加速器；

[中图分类号]R619+.6[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）01-0074-04

Experimental study of radiation therapy for hypertrophic scar in rabbits' ears

ZHAO Yue1, ZHANG Rong-ming2,ZHONNG Rui-jia3,HUANG Chao4,XING Shuang5,WU Cun-gang6,

(1.Studying for Master's Degree,The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical Univerisity, Jinzhou 121000,Liaoning,China;2.Department of Plastic Surgery,The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical Univerisity;3. Liaoning province EYE Hospital,Shenyang;4.Department of Stomatology,The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical Univerisity;5.Department of Ultrasound,The Third Affiliated Hospital of Liaoning Medical Univerisity;6.Department of Ultrasound,The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical Univerisity)

Abstract: ObjectiveThe study went through after the irradiation of high energy electronic wires which was conducted on the experimental model of hypertrophic scar of rabbits' ears. Observed the healing process and showed the pathological change as well as the variation of actin (ACTIN) and vascular endothelial growth factor (VEGF) after the healing of the scar.MethodsSelected 18 Japanese rabbits and made 10 models of circular full-thickness wound defects in the ventral side of per ear which each one was in the size of 6mm diameter. The total number of 360 wound defects was randomly divided into 6 groups. Group1 was the blank control group (3 samples), and the other 5 groups were the radiation group (3 samples in each group). Each wound defects on rabbits'ears was randomly irradiated with 200cGy, 400cGy, 600cGy, 800cGy, 1000cGy 6Mev electronic wires and the radiation field around was protected by the stereotype. Observed the change during the healing process and the progress of the scar tissue after the wound defects had already healed. Got the experimental material 1 month after the treatment injury and continued on the observations of the light microscopy,electron microscopy and histology.ResultsThe wound defects in the ventral side of the rabbits'ears could produce the similar hypertrophic scar like human beings. Each radiation group showed that the healing of the wound defects was delayed. Under the similar amount of the radiation, different volume of radiation per time could result a significant difference on the formation of the hypertrophic scar. ConclusionJapanese rabbits' could produce the similar pathological change of hypertrophic scar like human beings, and they could be the experimental animal model for the observation on pathological scar. This experiment proofed that radiation with 6 Mev pathological electronic wires is an effective way to cure the hypertrophic scar. Under the similar amount of the radiation, radiating 5 times fractionally which measured 400 Gy each time was the best quantities.

Key words:hypertrophic scar;radiotherapy;collagen fibers; electron linear accelerator

增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HS），也称之为肥厚性瘢痕，是临床上常见的一种病理性瘢痕，其形成是由于创伤愈合过程中成纤维细胞合成与分解代谢紊乱，导致细胞外基质合成增多和过度沉积[1]。增生性瘢痕常发生在外科手术、外伤和烧伤后，不仅影响了美观，而且会出现瘙痒、疼痛等症状，甚至能引起严重的功能障碍[2]。因此，对增生性瘢痕的治疗成为了美容领域研究的重点和难点。虽然治疗增生性瘢痕的方法有很多种，但是都达不到完全治愈的效果。增生性瘢痕的放射治疗始于 1906 年，已有上百年的历史。既可作为增生性瘢痕的首选治疗模式，也可以作为外科手术的辅助治疗方法。因为单纯手术切除复发率高，据国外报道烧伤后增生性瘢痕的发病率达91%,手术后为40%～94%,与我国临床报道相似[3]。而单独二氧化碳激光治疗后复发率也超过50%[4]。但由于相关的基础研究较少，利用放射的方法治疗瘢痕尚未达成统一的规范和标准，即影响了放射治疗的效果，也增加了并发症。而对于放射治疗的最佳时间和合理剂量的确定，已成为研究的热点之一。本研究拟采用医用直线加速器产生的6Mev高能电子线，在总照射剂量相近的情况下，对兔耳增生性瘢痕模型，进行单次不同剂量和不同次数照射，寻求最佳单次照射剂量和照射次数，为临床治疗增生性瘢痕提供理论依据。

1实验材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要实验试剂 、仪器及来源见表1。

1.1.2 实验材料：健康清洁级三四月龄日本大耳白兔18只，雌雄不限，体重范围1.5～2.0kg，由辽宁医学院实验动物中心提供。

1.2方法

1.2.1 模型制作：选用18只日本大耳白兔的36个耳朵，耳缘静脉3%戊巴比妥钠（1.5mg/Kg）注射麻醉，麻醉生效后，剃去耳腹侧兔毛，常规消毒铺巾，在无菌条件下每只兔耳腹侧面用自制打孔器制作直径为6mm的圆形全层皮肤（深达软骨膜）缺损创面10个，创面间隔1.5cm。各组实验动物在喂养期间活动及进食水情况良好，均存活。共计360个缺损创面模型。每三只兔子为一组，随机分为6组。其中1组作为对照组（60个创面），其余5组作为照射组，将照射组随机编号分成200cGy组（A组）、400cGy组（B组）、600cGy组（C组）、800cGy组（D组）、1000cGy组（E组），每组60个创面。照射组术后立即采用医用直线加速器产生的6Mev高能电子线照射兔耳腹侧面创面。照射方案为：A组（2000cGy连续照射10天，每日一次，单次照射剂量200cGy）、B组（2000cGy连续照射5天，隔日一次，单次照射剂量400cGy）、C组（1800cGy连续照射3天，隔3日一次，单次照射剂量600cGy）、D组（1600c连续照射2天，隔5日一次，单次照射剂量800cGy）、E组（2000cGy连续照射2天，隔5日一次，单次剂量1000cGy）。创面采用暴露法，被照射创口周围用铅板防护。实验动物模型制作一个月后，对照组和照射组均切取瘢痕组织，进行光镜、电镜及组织学观察分析。

1.2.2 标本的处理：照射组取材范围包括创口周围部分皮肤及创面下部薄层肌肉组织。将标本组织置于4%甲醛溶液中固定，石蜡包埋，常规切片后行HE染色。电镜标本按照实验试剂盒所指示步骤制作后，行免疫组织化学染色。

1.2.3 免疫组织化学染色：常规石蜡切片脱腊和水化后，PBS（0.01M，pH7.4）漂洗3次，每次5min；3%H2O2去离子水孵育10min，枸掾酸盐抗原修复液高温高压修复2min,自然冷却至室温后PBS漂洗3次，每次5min，去除剩余PBS液；滴加稀释的一抗后,37℃孵育90min，PBS冲洗3 次，每次2min；去除剩余 PBS,滴加PV - 9000 试剂1(聚合物辅助剂)50μl,37℃孵育20min，PBS冲洗3次，每次2min；去除剩余 PBS,滴加PV - 9000 试剂2(辣根酶标记羊抗兔/鼠Ig G多聚体)50μl,37℃孵育30min，PBS 冲洗3 次，每次2min；每张切片滴加100μl新鲜配制的DAB溶液,显微镜下控制染色10min；蒸馏水冲洗，苏木精复染1min，PBS冲洗返蓝,梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，镜下观察,拍照。

1.2.4 统计分析：采用SPSS14.0统计学软件，用χ2检验进行组间比较统计分析。P＜0.05有显著性差异。

2结果

2.1 大体观察情况：对照组的60个创面模型中，从第4天血痂形成，触之易脱落、出血，未发现瘢痕形成；第8天时，血痂形成比较牢固，未发现瘢痕形成；第11～13天时，创面开始愈合，血痂自动脱落，显露粉红色瘢痕组织；术后第12天开始，瘢痕组织逐渐高出皮肤，呈现淡红色，厚度约为兔耳厚度的1.5～2倍；术后30天时，60个创面，共形成增生性瘢痕48个，占80.0%，未形成增生性瘢痕12个，占20.0%。

2.2 不同照射方案对兔耳增生性瘢痕形成的影响：高能电子线照射组观察增生性瘢痕变化的过程与对照组相同。创伤7天后，A组、B组实验模型创面均无明显感染迹象，创面收缩变小明显；C组个别实验模型创面出现感染，经过创口抗感染处理后，情况好转；A、B、C3组实验模型创面，平均14天后，创口开始愈合；D组与E组，实验模型创面多处出现感染现象，伤口红肿、化脓、腐烂，创口经过抗感染处理后，仍未见明显好转。D组与E组，照射剂量对创口愈合的副作用较大，所以该两组的实验模型未纳入实验研究。

照射组A组,术后30天时，共形成增生性瘢痕28个，占46.7%，未形成增生性瘢痕32个，占53.3%；B组术后30天时，共形成增生性瘢痕23个，占38.3%，未形成增生性瘢痕37个，占61.7%；C组术后30天时，共形成增生性瘢痕36个，占60.0%，未形成增生性瘢痕24个，占40.0%；将照射后各组形成增生性瘢痕的结果进行比较发现，不同单次照射剂量，形成增生性瘢痕的数量不同。各剂量之间比较见表2。

2.3 HE染色：光学显微镜观察对照组1个月时瘢痕模型发现，表皮细胞层数较少，排列紧凑，上皮乳头消失，真皮层明显增厚，主要有大量的成纤维细胞增殖，成纤维细胞呈环形或旋涡状分布。其间见有大量的胶原纤维，排列致密且紊乱。见图1。

观察6Mev高能电子线照射组1个月时瘢痕模型发现，胶原纤维排列较整齐，成纤维细胞数量及血管数量少于对照组，随着照射量的增加，成纤维细胞的数量越少，胶原纤维也变的稀疏。见图2～4。

2.4 不同照射方案对VEGF、ACTIN表达的影响：各组增生性瘢痕组织中VEGF及ACTIN的表达情况见表3、3。免疫组化发现对照组VEGF、ACTIN的表达水平显著增高，表现为强阳性，照射组VEGF、ACTIN表达水平低于对照组，表现为阳性，见图5～12，表4；同时A组与B组中VEGF的表达有差异，而B与C组中VEGF的表达无显著差异。

3讨论

3.1 自20世纪50年代以来国内外学者一直在为建立增生性瘢痕的动物模型进行探索。我们参照Morris[5],李荟元和邢帮荣[6-7]建立兔耳增生性瘢痕模型的方法，在兔耳腹侧面成功建立了兔耳增生性瘢痕实验模型。组织病理学证明，对照组HE染色，镜下观察发现，成纤维细胞大量增殖，深层呈水平向排列，浅层呈环形或旋涡状排列，与人类的增生性瘢痕结构类似。而且创面愈合过程及增生组织的形成与人皮肤创伤后的愈合过程及增生性瘢痕形成有许多的相似之处。可能是因为兔耳腹侧面肉膜结构缺乏，其皮肤结构与人的皮肤结构相近，所以能形成与人类似的增生性瘢痕。该实验模型的建立，使检测增生性瘢痕组织中ACTIN和VEGF的表达情况成为可能，同时也为临床瘢痕的治疗研究提供了依据。

3.2 增生性瘢痕常继发于外伤、烧伤、烫伤、感染、耳环刺激、注射和手术后等。增生性瘢痕的发病机制涉及组织/器官、细胞、分子的各个环节，是一个错综复杂的相互作用、相互调控的过程，目前其具体机制仍不十分清楚[8]。增生性瘢痕的治疗也十分棘手。增生性瘢痕常用的治疗方法有有外科手术、激光疗法、冷冻治疗、放射疗法、加压疗法、硅凝胶治疗、药物治疗、中医治疗、基因治疗等。目前国内多采用高能电子线近距离放射治疗增生性瘢痕，但关于放射治疗的开始时间、照射次数、每次照射剂量和总照射剂量、连续照射还是间隔照射，看法与观点不一。主张术后早期照射的观点国内外学者已达成共识，但何时开始照射效果最好，还未形成共识。本实验采用不同剂量6Mev高能电子线分别照射5组实验动物模型，大体观察发现，D组与E组，实验模型创面多处出现感染现象，伤口红肿、化脓、腐烂，创口经过抗感染处理后，仍未见明显好转。由于D组与E组的照射剂量对创口愈合的副作用较大，所以该两组的实验模型未纳入实验研究。A组与B组比较发现，瘢痕数量、形态差异无显著性，B组与C组相比较差异有显著性。而在C组中，有个别的创面出现了感染现象，经过抗感染治疗后情况好转。由此可见，放射治疗增生性瘢痕时，在一定范围内不发生皮肤损伤的情况下，应加大单次照射剂量。故在本实验中，400cGy的单次照射剂量治疗增生性瘢痕饿效果更佳。

3.3 HS形成的病理过程跟创伤愈合的细胞增殖期各种活性因素有关。其瘢痕组织则是由大量不规则组织基质形成的成纤维细胞构成[9]。电镜下观察瘢痕标本发现，对照组有成纤维细胞大量增殖，呈环形或旋涡状分布。其间可见大量的胶原纤维，排列致密且紊乱。照射组瘢痕模型标本中发现，胶原纤维排列较整齐，成纤维细胞数量和血管数量与对照组相比，明显减少。这可能是因为直线加速器产生的6Mev高能电子线照射的结果，使胶原纤维的再形成过程中，减少胶原纤维的过度增生，抑制成纤维细胞的增殖，避免了增生性瘢痕的形成。

3.4 在瘢痕组织的表皮、真皮微血管、部分皮肤附属器中VEGF表达增强，说明了在瘢痕组织中有新生血管形成。新生血管的形成为瘢痕组织的增生提供了营养基础，可能在瘢痕组织的形成、发展过程中起着相当重要的作用。岳毅刚等[10]把不同浓度的VEGF单克隆抗体注射进裸鼠增生性瘢痕模型体内发现：VEGF抗体可以通过阻断VEGF的作用，抑制胶原纤维合成和增生性瘢痕生长。瘢痕挛缩是由ACTIN为主要成分的微丝和钙离子等构成的非肌性细胞收缩系统在起作用。在整个过程中，肌成纤维细胞是瘢痕挛缩的动力来源。增生性瘢痕抗纤维化的中心策略是抑制成纤维细胞的增殖与分化[11]。研究表明，任何非手术治疗瘢痕有效的方法，都应该直接或间接针对抑制成纤维细胞增殖和调整胶原代谢异常这一重要环节[12]。

3.5 照射组各瘢痕模型中VEGF及ACTIN的表达降低，其中A组与B组、C组比较差异有显著性，而B组与C组比较差异无显著性。由此可以得出B组与C组放射治疗效果较A组效果明显。主要原因可能就是由于加速器产生的高能电子线照射后导致成纤维细胞坏死或凋亡，破坏胶原合成和降解的平衡所致。

3.6 经大规模多中心统计学调查显示：合理放疗并不会增加恶性肿瘤发生的可能[13]。综上所述，治疗增生性瘢痕时，在不引起皮损、使成纤维细胞坏死或凋亡并破坏胶原合成和降解平衡前提下，可以适当的增加6Mev高能电子线单次照射剂量，其最佳照射剂量为400cGy。

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[收稿日期]2011-08-11 [修回日期]2011-11-27

编辑/张惠娟