橘皮提取物的抗氧化能力与有效成分分析

2012-04-29淡小艳，王芳，薛佳尔，谢依锦

湖北农业科学 2012年14期

淡小艳，王芳，薛佳尔，谢依锦

摘要：用不同溶剂（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、去离子水）于室温对橘皮进行提取，得到不同溶剂的橘皮提取物。研究５种溶剂的橘皮提取物对１，１－二苯基－２－苦基肼（ＤＰＰＨ）和亚硝酸盐的清除能力，并考察其有效成分的含量。结果表明，５种溶剂的橘皮提取物均具有清除ＤＰＰＨ和亚硝酸盐的能力，其中乙酸乙酯提取物的清除能力最强。在５种溶剂的橘皮提取物中柠檬苦素含量有极显著差异，黄酮、总酚的含量也如此；而氯仿提取物和石油醚提取物的单宁含量差异不显著，其他３种提取物的单宁含量差异极显著。乙酸乙酯提取物中各有效成分含量均最高，且相关性分析表明，橘皮提取物清除ＤＰＰＨ和亚硝酸盐的能力与其黄酮含量之间存在显著的相关性。

关键词：橘皮；提取物；１，１－二苯基－２－苦基肼（ＤＰＰＨ）；亚硝酸盐；抗氧化能力；有效成分

中图分类号：ＴＳ２０２．３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）14－3052-04

Antioxidant ＡｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅＥｘｔｒａｃｔｓｆｒｏｍＯｒａｎｇｅＰｅｅｌｓ and Its Effectire Components

ＤＡＮＸｉａｏ－ｙａｎ，ＷＡＮＧＦａｎｇ，ＸＵＥＪｉａ－ｅｒ，ＸＩＥＹｉ－ｊｉｎｇ

(College of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, Zhejiang, China)

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｓｏｆｏｒａｎｇｅｐｅｅｌｓｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄａｔｒｏｏｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｕｓｉｎｇｐｅｔｒｏｌｅｕｍｅｔｈｅｒ，ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ，ｅｔｈｙｌａｃｅｔａｔｅ，ｎ－ｂｕｔｙｌａｌｃｏｈｏｌａｎｄｗａｔｅｒａｓｓｏｌｖｅｎｔ．ＴｈｅＤＰＰＨｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌａｎｄｎｉｔｒｉｔｅｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｃａｐａｃｉｔｙｏｆｔｈｅ５ｅｘｔｒａｃｔｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ；ａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｔｈｅｉｒｍａｉｎａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｗｅｒｅｅｘａｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔａｌｌｔｈｅｆｉｖｅｅｘｔｒａｃｔｓｆｒｏｍｔｈｅｏｒａｎｇｅｐｅｅｌｓｈａｄａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｎｉｔｒｉｔｅ－ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ．Ａｎｄｔｈｅｓｔｒｏｎｇｅｓｔａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎｅｔｈｙｌａｃｅｔａｔｅｅｘｔｒａｃｔ．Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｌｉｍｏｎｉｎ，ｆｌａｖｏｎｏｉｄ，ｔｏｔａｌｐｈｅｎｏｌｉｃｓａｎｄｔａｎｎｉｎｓｏｆｔｈｅｆｉｖｅｅｘｔｒａｃｔｓｗａｓｄｉｆｆｅｒｅｎt．Ｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｈｅｆｏｕｒｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｅｔｈｙｌａｃｅｔａｔｅｅｘｔｒａｃｔ；ａｎｄｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｅｘｈｉｂｉｔｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｎｉｔｒｉｔｅ－ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｓｆｒｏｍｏｒａｎｇｅｐｅｅｌｓ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｏｒａｎｇｅｐｅｅｌ；ｅｘｔｒａｃｔ；ＤＰＰＨ；ｎｉｔｒｉｔｅ； antioxidant ａｂｉｌｉｔｙ； effective component

柑橘为中国著名果品之一，年产量超过１０７ｔ［１］。橘皮约占柑橘质量的２０％～４０％，除含维生素Ｃ、精油外，还含有丰富的黄酮类物质［２，３］。近年来，国内外关于橘皮抗氧化成分的研究较多，并取得了较大的进展。已有的报道表明天然橘皮中含有的黄酮类、酚类、精油、色素类、柠檬苦素等都是具有开发潜力的抑菌和抗氧化的化学成分［４－６］。随着人们对食品安全的关注程度不断加大，开发能够清除食品中亚硝酸盐的天然活性物质具有广阔的市场前景。目前橘皮的天然提取物对亚硝酸盐清除能力的研究尚未见报道，以橘皮为研究材料，分别使用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、去离子水５种不同极性的溶剂进行常压提取，测定５种提取物对１，１－二苯基－２－苦基肼（ＤＰＰＨ）和亚硝酸盐的清除能力，并分析其中有效成分的含量，旨在为橘皮的进一步开发利用提供理论依据。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１原料与试剂柑橘购自浙江省金华市水果市场，于４５ ℃条件下将新鲜橘皮烘干，用粉碎机粉碎得橘皮粉，于４ ℃保存备用；ＤＰＰＨ购自日本和光纯药工业株式会社，柠檬苦素标准品购自上海锐谷生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯，购自金华市医药有限公司。

１．１．２仪器与设备料理机购自九阳股份有限公司，ＤＺＦ－９１４０Ｂ型真空干燥箱购自上海一恒科学仪器有限公司，Ｒ－１００１－Ｌ旋转蒸发仪购自郑州长城科工贸有限公司，ＵＶ１０００紫外可见分光光度计购自上海天美科学仪器有限公司。

１．２方法

１．２．１５种溶剂的橘皮提取物的制备取５０ｇ橘皮粉，分别加入５００ｍＬ石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和去离子水，提取６ｈ，离心，收集上清液，再同法提取３次。合并上清液，用旋转蒸发仪浓缩，回收溶剂。将浓缩后的样品放入５５ ℃烘箱中烘干，得到５种膏状提取物，于４ ℃冰箱中备用。

１．２．２对ＤＰＰＨ清除能力的测定精确称取１２．０ｍｇＤＰＰＨ，用无水乙醇溶解并定容于２５０ｍＬ容量瓶中，ＤＰＰＨ浓度为０．１２ｍｍｏｌ／Ｌ，避光保存［７］。

将不同溶剂提取物用无水乙醇配成浓度为０．０５、０．１０、０．２０、０．４０和０．８０ｍｇ／ｍＬ的样品液，取２ｍＬ待测样品，加入２ｍＬ０．１２ｍｍｏｌ／ＬＤＰＰＨ溶液，混匀避光放置３０ｍｉｎ，在５１７ｎｍ处测其吸光度（Ａｉ）；以溶剂为参比，于５１７ｎｍ处测定吸光度（Ａｃ）；同时，取待测样品２ｍＬ，加入２ｍＬ无水乙醇，混匀，于５１７ｎｍ处测定吸光度（Ａｊ）。ＤＰＰＨ清除率＝［１－（Ａｉ－Ａｊ）／Ａｃ］×１００％。

１．２．３对亚硝酸盐清除能力的测定采用盐酸萘乙二胺法［８］。向２５ｍＬ比色管中加入２ｍＬ２５ μｇ／ｍＬＮａＮＯ２标准溶液、３ｍＬ样品液（不同提取物用去离子水配成的，浓度为０．０５、０．１０、０．２０、０．４０、０．８０ｍｇ／ｍＬ），迅速加入适量０．０５ｍｏｌ／Ｌ HCl调至ｐＨ３，于８０ ℃水浴１０ｍｉｎ，然后加入１ｍＬ４ｇ／Ｌ对氨基苯磺酸混合均匀，静置３～５ｍｉｎ，加入０．５ｍＬ２ｇ／Ｌ盐酸萘乙二胺，振荡混匀，加去离子水定容至２５ｍＬ，静置１５ｍｉｎ，以相应的试样空白调零，测定５３８ｎｍ波长处的吸光度（Ａ样品），亚硝酸盐清除率按以下公式计算：清除率＝［１－（Ａ样品－Ａ样空）／Ａ对照］×１００％，式中，Ａ对照为用３ｍＬ去离子水代替对应体积的样品液试验测得的吸光度；Ａ样空为用２ｍＬ去离子水代替２ｍＬ 25 μｇ／mＬＮａＮＯ２标准溶液试验测得的吸光度。

１．２．４有效成分含量的测定方法

１）总酚含量的测定。采用Ｆｏｌｉｎ－Ｃｉｏｃａlteu试剂比色法［９］。精确称取０．００５ｇ没食子酸标准样品，用去离子水溶解并定容至５０ｍＬ，标准溶液浓度为０．１ｍｇ／ｍＬ。准确量取上述标准溶液０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０ｍＬ于７个５０ｍＬ容量瓶中，各加３０ｍＬ去离子水，摇匀，再加２．５ｍＬ福林酚试剂，充分摇匀。１ｍｉｎ后加入７．５ｍＬ２００ｇ／ＬＮａ２ＣＯ３溶液，混匀。在７５ ℃水浴反应１０ｍｉｎ，于７６０ｎｍ波长下测定吸光度，以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线。用最小二乘法作线性回归。按照同样的方法测定样品的吸光度，带入得到的标准方程中即可得到样品总酚的浓度，从而得到提取物总酚的含量。

２）黄酮含量的测定。称取２０ｍｇ芦丁，用体积分数为１０％的乙醇定容至２５ｍＬ，备用。取７支具塞试管，分别加入０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０ｍＬ芦丁标准溶液，用体积分数为３０％的乙醇补足体积至５ｍＬ，混匀，各加入０．３ｍＬ５０ｇ／ＬＮａＮＯ２，混匀静置５ｍｉｎ，加入０．３ｍＬ１００ｇ／ＬＡｌ（ＮＯ３）３，混匀后静置６ｍｉｎ，加入４ｍＬ１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ，再加入０．４ｍＬ体积分数为３０％的乙醇使总体积为１０ｍＬ，混匀后静置１０ｍｉｎ，用ＵＶ１０００紫外可见分光光度计于５１０ｎｍ处测定吸光度，以试剂为空白参比。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线。用最小二乘法作线性回归。按照同样的方法测定样品的吸光度，带入得到的标准方程中即可得到样品黄酮的浓度［１０］，从而得到提取物黄酮的含量。

３）单宁含量的测定。采用香草醛比色法［１１］。准确称取０．０５ｇ单宁溶于５０ｍＬ甲醇中，分别取上述标准溶液０、０．５、１．０、１．５、２．０ｍＬ，依次加入２．０、１．５、１．０、０．５、０ｍＬ甲醇，然后加２ｍＬ４０ｇ／Ｌ香草醛溶液和１．０ｍＬ浓盐酸，于３０ ℃水浴加热２０ｍｉｎ，冷却，在５１０ｎｍ处测定吸光度。以单宁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线。用最小二乘法作线性回归。按照同样的方法测定样品的吸光度，带入得到的标准方程中即可得到样品单宁的浓度，从而得到提取物单宁的含量。

４）柠檬苦素含量的测定。反应液的制备：将１２５ｍｇ对二－甲氨基苯甲醛溶解于１００ｍＬ体积比为３５∶６５的硫酸、无水乙醇混合液中，加入０．５ｍＬ９ｇ／Ｌ三氯化铁溶液，现配现用。标准曲线的制作：将柠檬苦素标准品用无水甲醇配成１３０ μｇ／ｍＬ的标准溶液，在６支试管中分别加入０、０．５、０．８、１．２、１．５和２．０ｍＬ标准溶液，分别加无水乙醇至２．０ｍＬ，加入反应液５．０ｍＬ，摇匀，静置３０ｍｉｎ，在５００ｎｍ处测定吸光度，以空白溶液为参比溶液。以柠檬苦素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线。用最小二乘法作线性回归。按照同样的方法测定样品的吸光度，带入得到的标准方程中即可得到样品柠檬苦素的浓度［１２］，从而得到提取物柠檬苦素的含量。

２结果与分析

２．１有效成分含量测定中各标准方程的建立

１）总酚含量的测定。吸光度（ｙ）与没食子酸浓度（ｘ//μｇ/ｍＬ）的标准曲线的标准方程为＝０．１４４ 0ｘ－０．０３０６，ｒ＝０．９９３９。

２）黄酮含量的测定。吸光度（ｙ）与芦丁浓度（ｘ//ｍｇ/ｍＬ）的标准曲线的标准方程为＝１．３０１９ｘ＋０．００１７，ｒ＝０．９９９９。

３）单宁含量的测定。吸光度（ｙ）与单宁浓度（ｘ//ｍｇ／１００ｍＬ）的标准曲线的标准方程为＝０．４９７５ｘ－０．０２１７，ｒ＝０．９９７７。

４）柠檬苦素含量的测定。吸光度（ｙ）与柠檬苦素浓度（ｘ//ｍｇ/ｍＬ）的标准曲线的标准方程为＝５．２３５ 0ｘ－０．１０４５，ｒ＝０．９９０７。

２．２不同溶剂的橘皮提取物对ＤＰＰＨ的清除能力

由图１可知，不同溶剂的橘皮提取物对ＤＰＰＨ都具有清除作用，清除率与提取物的浓度存在剂量效应关系，当提取物的浓度为０．８0 ｍｇ／ｍＬ时，乙酸乙酯提取物对ＤＰＰＨ的清除率达到９４．２％。由ＩＣ５０计算小软件可以计算出５种溶剂的橘皮提取物的ＩＣ５０分别为乙酸乙酯０．１０６ｍｇ／ｍＬ、正丁醇０．１７１ｍｇ／ｍＬ、氯仿０．３１１ｍｇ／ｍＬ、去离子水０．５８４ｍｇ／ｍＬ和石油醚０．８８７ｍｇ／ｍＬ，可见５种溶剂的橘皮提取物中乙酸乙酯提取物对ＤＰＰＨ的清除能力最强。

２．３不同溶剂的橘皮提取物对亚硝酸盐的清除能力

由图２可知，５种溶剂的橘皮提取物对亚硝酸盐均有一定的清除作用，且清除率与提取物的浓度存在剂量效应关系，当提取物的浓度为０．８0 ｍｇ／ｍＬ时，乙酸乙酯提取物对亚硝酸盐的清除率达到６４．２％。由ＩＣ５０计算小软件计算得出５种溶剂的橘皮提取物的ＩＣ５０分别为：乙酸乙酯０．３６６ｍｇ／ｍＬ、正丁醇０．５３３ｍｇ／ｍＬ、氯仿１．０２０ｍｇ／ｍＬ、去离子水１．８１０ｍｇ／ｍＬ和石油醚４．４１９ｍｇ／ｍＬ，与清除ＤＰＰＨ的能力表现出相同的特点，５种溶剂的橘皮提取物中乙酸乙酯提取物对亚硝酸盐的清除能力最强。

２．４不同溶剂的橘皮提取物中有效成分的含量

由表１可知，乙酸乙酯提取物中４种有效成分的含量远高于其他溶剂提取物中各成分的含量，黄酮含量最高，达４０．４０ｍｇ／ｇ；不同溶剂的橘皮提取物中黄酮含量均为最高。由ＳＰＳＳ１８．０软件计算可知，柠檬苦素含量在５种溶剂的橘皮提取物中有极显著差异，黄酮、总酚的含量也如此；氯仿提取物和石油醚提取物的单宁含量差异不显著，其他３种提取物单宁含量差异极显著。

２．５橘皮提取物中有效成分与对ＤＰＰＨ和亚硝酸盐清除能力的相关性

橘皮提取物中黄酮、柠檬苦素、总酚和单宁含量与提取物对ＤＰＰＨ和亚硝酸盐清除能力的相关性分析结果如表２所示。由表２可知，黄酮含量与ＤＰＰＨ清除率之间呈显著正相关，其相关系数为０．９３６，与亚硝酸盐清除率之间呈极显著正相关，其相关系数为０．９６９，所以黄酮含量与提取物对ＤＰＰＨ和亚硝酸盐的清除能力之间有良好的相关性。柠檬苦素和总酚的含量与亚硝酸盐清除率之间也呈显著正相关。

３结论

５种不同极性溶剂的橘皮提取物均具有清除ＤＰＰＨ和亚硝酸盐的能力，其中乙酸乙酯提取物的清除能力最强，表明橘皮中具有清除ＤＰＰＨ和亚硝酸盐能力的活性成分主要为中等极性的成分，乙酸乙酯是较为适宜的提取溶剂。

柠檬苦素含量在５种溶剂的橘皮提取物中有极显著差异，黄酮、总酚的含量也如此；而氯仿提取物和石油醚提取物的单宁含量差异不显著，其他３种提取物单宁含量差异极显著。且５种溶剂的橘皮提取物中黄酮的含量均最大，而且黄酮含量与提取物清除ＤＰＰＨ的能力呈显著正相关，与提取物清除亚硝酸盐的能力呈极显著正相关，柠檬苦素与总酚的含量与提取物清除亚硝酸盐的能力呈显著正相关，因此推测橘皮的主要抗氧化成分为黄酮，清除亚硝酸盐的主要活性成分为黄酮、柠檬苦素、总酚等成分。

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