脐橙黄酮体外的抗氧化作用

2012-04-29刘霞李伟范小娜

湖北农业科学 2012年14期

刘霞李伟范小娜

摘要：加入不同浓度的脐橙（ＣｉｔｒｕｓｓｉｎｅｎｓｉｓＯｓｂｅｃｋ）黄酮，研究脐橙黄酮体外清除活性氧自由基邻苯三酚的作用，并与维生素Ｃ、体积分数为５０％的乙醇的作用进行比较。结果表明，脐橙黄酮浓度为３．０１ｍｇ／ｍＬ时对邻苯三酚的清除率与１ｍｇ／ｍＬ维生素Ｃ相比无显著差异（Ｐ＞０．０５），与体积分数为５０％的乙醇及去离子水相比差异极显著（Ｐ＜０．０１）。脐橙黄酮具有较强地清除体外活性氧自由基的作用。

关键词：脐橙（ＣｉｔｒｕｓｓｉｎｅｎｓｉｓＯｓｂｅｃｋ）；黄酮；抗氧化；活性氧自由基

中图分类号：Ｓ６６６．４文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）14－3050-02

Study on in vitro Antioxidation of Navel Orange Flavonoids

ＬＩＵＸｉａａ，ＬＩＷｅｉｂ，ＦＡＮＸｉａｏ－ｎａｃ

（ａ．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ；ｂ．ＲｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅ；ｃ．ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｓｅａｒｃｈＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ，ＧａｎｎａｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇａｎｚｈｏｕ３４１０００，

Ｊｉａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｉｎｖｉｔｒｏｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｎａｖｅｌｏｒａｎｇｅ（ＣｉｔｒｕｓｓｉｎｅｎｓｉｓＯｓｂｅｃｋ）ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｂｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｔｈｅａｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｐｙｒｏｇａｌｌｏｌａｆｔｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｎａｖｅｌｏｒａｎｇｅｓｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｗａｓａｄｄｅｄ．ＶｉｔａｍｉｎＣａｎｄ５０％ａｌｃｏｈｏｌｗａｓｕｓｅｄａｓｃｏｍｐａｒｅ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｒｅｖｅａｌｅｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＞０．０５）ｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆ１ｍｇ／ｍＬｖｉｔａｍｉｎＣａｎｄ３．０１ｍｇ／ｍＬｎａｖｅｌｏｒａｎｇｅｓｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆｎａｖｅｌｏｒａｎｇｅｓｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ was ｖｅｒｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔ（Ｐ＜０．０１）ｆｒｏｍｔｈａｔｏｆ５０％ｅｔｈａｎｏｌａｎｄＣＫ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｎａｖｅｌｏｒａｎｇｅｓｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｈａｄｓｔｒｏｎｇｉｎｖｉｔｒｏａｂｉｌｉｔｙｉｎｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｎａｖｅｌｏｒａｎｇｅｓ；ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ；ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｒａｄｉｃａｌ

赣南脐橙（ＣｉｔｒｕｓｓｉｎｅｎｓｉｓＯｓｂｅｃｋ）营养丰富，含有人体所必需的各类营养成分。赣南气候温暖，雨水充沛，昼夜温差大，具有得天独厚的气候资源优势，非常适宜种植脐橙，脐橙皮中含有丰富的天然黄酮类化合物［１］。研究表明黄酮类化合物具有降脂、抗血栓、抗氧化、抗衰老、抗心率失常等作用，因而广泛用于医药、食品等行业，具有极广的开发应用前景［２－４］。研究通过比较维生素Ｃ、乙醇和脐橙黄酮对邻苯三酚的清除率，并研究不同浓度脐橙黄酮清除活性氧自由基的作用，旨在为更加深入地研究脐橙黄酮的作用提供一定的依据。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１主要仪器ＵＶ－１６０１紫外可见分光光度计购自日本岛津公司，ＥＹＥＬＡＮ－１００１旋转蒸发仪购自上海爱明仪器有限公司，ＳＨＺ－ＪＩＩＡ型循环水式真空泵购自西安波意尔精密仪器有限公司。

１．１．２原料与试剂橙皮粉为市售赣南脐橙果皮在５０ ℃恒温烘干后粉碎过５０目筛所得，纯度为９９．０％的橙皮苷标准品购于中国药品生物制品检定所，三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）、乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）、邻苯三酚、维生素Ｃ、无水乙醇、ＮａＯＨ、HCl均为分析纯。

１．２方法

１．２．１试剂的配制０．２ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ：称取２．４２３ｇＴｒｉｓ，以去离子水溶解定容至１００ｍＬ；Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ－ＥＤＴＡ缓冲液：５０ｍＬ０．２ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ与４６ｍＬ０．１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ混合，内含１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，ｐＨ８．２，定容至１００ｍＬ；４５ｍｍｏｌ／Ｌ邻苯三酚：称取５６７．５ｍｇ邻苯三酚，用０．０１ｍｏｌ／ＬＨＣＩ溶解定容至１００ｍＬ，溶液须临用前现配；１ｍｇ／ｍＬ维生素Ｃ：称取５０ｍｇ维生素Ｃ，用去离子水溶解定容至５０ｍＬ。

１．２．２样品的处理准确称取５ｇ样品放入圆底烧瓶中，加入１００ｍＬ体积分数为５０％的乙醇，于７０ ℃提取３ｈ，抽滤，从滤液回收乙醇，使浓缩液ｐＨ５，静置过夜，待黄酮全部沉淀析出，离心，得黄酮［５］。

１．２．３橙皮苷标准曲线的绘制准确称量２．２３８ｍｇ纯度为９９．０％的橙皮苷标准品，用含１ｇ／ＬＮａＯＨ的体积分数为７５％的乙醇溶液溶解并定容于２５ｍＬ容量瓶中，摇匀，得浓度为８９．５２ μｇ／ｍＬ标准品溶液。准确吸取该标准品溶液０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０ｍＬ分别置于１０ｍＬ比色管中，用含１ｇ／ＬＮａＯＨ的体积分数为７５％的乙醇溶液定容至刻度。标准品溶解１ｈ后，以含１ｇ／ＬＮａＯＨ的体积分数为７５％的乙醇溶液为空白，在３６０ｎｍ波长处测定这一系列溶液的吸光度，以吸光度（ｙ）为纵坐标、橙皮苷浓度（ｘ）为横坐标作标准曲线［６］，该标准曲线的回归方程＝０．０１８１ｘ－０．０６９２，ｒ＝０．９９９７。

１．２．４样品中黄酮含量的测定将通过方法１．２．２所得的黄酮用含１ｇ／ＬＮａＯＨ的体积分数为７５％的乙醇溶液溶解并定容于５０ｍＬ容量瓶中，摇匀，用移液管精确移取０．１ｍＬ于１０ｍＬ比色管中，用方法１．２．３测定其在３６０ｎｍ的吸光度，然后按照下述公式计算赣南脐橙皮中的黄酮得率：黄酮得率＝［（ｙ＋０．０６９２）×５０００×１０－６／（０．０１８１×５）］×１００％。式中，ｙ为黄酮溶液在３６０ｎｍ处的吸光度；５０００为黄酮的稀释倍数；１０－６为μｇ与ｇ之间的单位换算；５为样品质量（ｇ）。计算得黄酮得率为３．０１％，黄酮浓度为３．０１ｍｇ／ｍＬ。

１．２．５试验设计

１）不同清除剂对邻苯三酚的清除率。取４个试管标记为１、２、３、４，每组中分别加入４．５ｍＬｐＨ８．２的Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ－ＥＤＴＡ缓冲液，于２５ ℃水浴预热２０ｍｉｎ，然后在１、２、３、４号管中分别加入3.01 mg/mL脐橙黄酮、１ｍｇ／ｍＬ维生素Ｃ、体积分数为５０％的乙醇和去离子水各０．１ｍＬ，再各加入邻苯三酚０．４ｍＬ，摇匀，于３２１ｎｍ处测定作用１、２、４、６、８、１０ｍｉｎ时的吸光度，３次重复。清除率ｄ＝［（Ａ空白－Ａ样品）／Ａ空白］×１００％。

２）不同浓度脐橙黄酮对邻苯三酚的清除率。将通过方法１．２．２所得的黄酮用含１ｇ／ＬＮａＯＨ的体积分数为７５％的乙醇溶液溶解并定容于５０ｍＬ容量瓶中，摇匀；分别精密量取该溶液，用含１ｇ／ＬＮａＯＨ的体积分数为７５％的乙醇溶液稀释制成０．３、０．６、０．９、１．２、１．５、１．８、２．１、２．４、２．７和３．０ｍｇ／ｍＬ的脐橙黄酮溶液。仿前述“不同清除剂对邻苯三酚的清除率”的研究方法，研究不同浓度脐橙黄酮对邻苯三酚的清除率。

１．２．６统计学处理数据使用ＳＰＳＳ１１．５软件统计。

２结果与分析

２．１不同清除剂对邻苯三酚的清除率

由表1可知，作用ｌ、２、４、６、８、１０ｍｉｎ后，３．０１ｍｇ／ｍＬ脐橙黄酮对邻苯三酚的清除率分别为３９．９３％、４５．４７％、３４．９６％、２８．９５％、２４．７３％、１９．９２％，随着作用时间的延长，清除率先升后降，平均清除率为３２．３３％±９．６０％，１ｍｇ／ｍＬ维生素Ｃ和体积分数为５０％的乙醇对邻苯三酚的平均清除率分别为３９．０７％±４．７８％和７．９９％±４．２２％。３．０１ｍｇ／ｍＬ脐橙黄酮对邻苯三酚的清除率与体积分数为５０％的乙醇及去离子水（对照）相比差异极显著（Ｐ＜０．０１），与１ｍｇ／ｍＬ维生素Ｃ间无显著差异（Ｐ＞０．０５）。

２．２不同浓度脐橙黄酮对邻苯三酚的清除率

由图１可知，随着脐橙黄酮浓度的增大，对邻苯三酚的清除率提高，当脐橙黄酮浓度为０．３ｍｇ／ｍＬ时，对邻苯三酚的清除率低于１０％，说明提取物对邻苯三酚的清除率与脐橙黄酮浓度有关。

３结论与讨论

上述结果表明，脐橙皮提取物有类似超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）的作用，能较强地清除活性氧自由基（Ｏ２－·），作用效果随着浓度的增加而增强，呈非线性的剂量关系。橙皮苷是柑橘黄酮中最重要的一种，抗氧化活性较低，需要在较高浓度下才表现出一定的抗氧化活性。试验中脐橙黄酮和维生素Ｃ都有很强的体外清除活性氧自由基的作用，可应用于抗氧化保健食品中。脐橙黄酮浓度为３．０１ｍｇ／ｍＬ时对邻苯三酚的清除率与１ｍｇ／ｍＬ维生素Ｃ相比无显著差异（Ｐ＞０．０５），说明脐橙黄酮浓度比维生素Ｃ浓度大才达到相似的清除率。因此，脐橙作为赣南地区的特产，它将是一种有应用前景的活性氧自由基清除剂，其药用价值可被大力开发利用。

参考文献：

［１］蔡定建，谢志鹏，罗六保，等．脐橙皮中黄酮类化合物与果胶的分离和提取研究［Ｊ］．分析测试技术与仪器，２００６，１２（４）：２３９－２４２．

［２］刘成伦．黄酮类化合物抗氧化性质的研究进展［Ｊ］．食品研究与开发，２００６，２７（５）：１５８－１６８．

［３］张玉萌．黄酮类化合物抗肿瘤作用分子机制研究进展［Ｊ］．中国药物应用与监测，２００６（６）：５０－５３．

［４］王玮，王琳．黄酮类化合物的研究进展［Ｊ］．沈阳医学院学报，２００２，４（２）：１１５－１１９．

［５］张国文，杨佳，何力，等．醇法提取赣南脐橙皮中黄酮类化合物的工艺研究［Ｊ］．南昌大学学报（工科版），２００９，３１（３）：２０５－２０９．

［６］卢静华，王亚娟，于玲．陈皮中橙皮苷超声提取工艺研究［Ｊ］．时珍国医国药，２００６，1７（４）：６０４－６０７．