叶绿素降解菌的筛选与应用

陈志良,李海云,李子院,郝再彬

摘要：以叶绿素为培养基成分，在不添加无机盐的条件下，从土壤中分离筛选得到一株能降解叶绿素的菌株；经过形态学鉴定，确定它为曲霉属中的一种，菌株命名为ＧＬＨＺＢ３１９，保藏在中国典型培养物保藏中心内，保藏编号为ＣＣＴＣＣ Ｎｏ： Ｍ２０１１１０１。在温度为３０ ℃、摇床转速１００ ｒ／ｍｉｎ、自然ｐＨ、ＧＬＨＺＢ３１９菌株接种孢子量为１．０×１０６个／ｍＬ的培养条件下，把１００ ｍＬ的叶绿素水溶液培养３ ｄ，溶液的吸光度值由０．３１０降解到０．００２，降解率达到９９％。

关键词：叶绿素；降解菌；筛选

中图分类号：Ｑ９４５．１１；Ｑ９４８．１２＋２．３；Ｑ９３９．９７文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）14－2992-04

Screening and Application of Chlorophyll Degradation Bacterium

ＣＨＥＮ Ｚｈｉ－ｌｉａｎｇ，ＬＩ Ｈａｉ－ｙｕｎ，ＬＩ Ｚｉ－ｙｕａｎ，ＨＡＯ Ｚａｉ－ｂｉｎ

（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｇｕｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Tｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕｉｌｉｎ ５４１００４，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔａｋｉｎｇ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ａｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ， ａｎｄ ａｄｄｉｎｇ ｎｏ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ， ａ ｓｔｒａｉｎ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｉｌ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｉｔ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｍｉｃｈ．ｅｘ Ｌｉｎｋ：Ｆｒ．． Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｎａｍｅｄ ＧＬＨＺＢ３１９， ａｎｄ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Cｏｌｌｅｃｔｓ ｎｕｍｂｅｒ： ＣＣＴＣＣ Ｎｏ： Ｍ２０１１１０１）． Ａｔ ３０ ℃， ｓｈａｋｉｎｇ ｓｐｅｅｄ １００ ｒ／ｍｉｎ， ｎａｔｕｒａｌ ｐＨ， ｗｉｔｈ ＧＬＨＺＢ３１９ ｎａｔｕｒａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｔｙ １.0×１０６ ｉｎｄ．／ｍＬ， ｔｈｅ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ １００ ｍＬ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ０．３１０ ｔｏ ０．００２ ａｆｔｅｒ ３ ｄ， ｗｉｔｈ ａ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ９９％．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ； ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ； ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ

叶绿素广泛存在于植物体内及藻类、光合细菌中，分布的部位主要是内囊体膜；叶绿素类型主要包括叶绿素ａ和叶绿素ｂ，其中叶绿素ａ占的比例较大，通常叶绿素ａ∶叶绿素ｂ＝３∶１，它们难溶于水，但能溶于乙醇、丙酮和石油醚等有机溶剂［１，２］。叶绿素是叶绿酸的二醇酯，是由叶绿酸（镁卟啉衍生物、二元羧酸）的两个羧基分别与甲醇（ＣＨ4Ｏ）和植醇（Ｃ２０Ｈ40Ｏ）发生酯化反应所形成的，是对光、热、酸等环境条件不稳定的物质［３－６］。叶绿素ａ和叶绿素ｂ在结构上的差别仅在于第二吡咯环上的一个－ＣＨ３被－ＣＨＯ所取代［７，８］。

在植物界有７ ０００多种植物可供人类食用，在民间约有５ ０００种草药用来治疗日常的各种疾病，在中药材中有４０％是由绿色植物提供。现代食品和药品的提取需要脱除叶绿素［９］，目前在工业生产上脱除叶绿素的方法主要有：①物理吸附法，包括大孔树脂吸附法和活性炭吸附法；②化学氧化法，包括双氧水氧化法或次氯酸钠氧化法；不过这两类方法都存在一定的局限性。而采用生物工程技术方法降解叶绿素是环境友好型的处理方法，是未来发展的方向［１０］。

试验通过微生物培养，利用叶绿素为培养基成分，在未添加无机盐的情况下，从土壤中分离出一株能够降解叶绿素的菌株，经显微形态观察分析，鉴定为曲霉属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｍｉｃｈ．ｅｘ Ｌｉｎｋ：Ｆｒ．）［１１］，命名为ＧＬＨＺＢ３１９菌株，并保藏在中国典型培养物保藏中心里，保藏编号ＣＣＴＣＣ Ｎｏ：Ｍ２０１１１０１。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１试剂与用品主要试剂如丙酮、碳酸钙、葡萄糖、２０％甘油等都为化学纯；琼脂为食品级，马铃薯为市售；叶绿素为桂林理工大学化学与生物工程学院实验室从中华猕猴桃（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｐｌａｎｃｈ）叶片里提取［１２］；剑麻（Ｙｕｃｃａ ｇｌｏｒｉｏｓａ Ｌ．）麻丝由南宁剑麻集团提供。

１．１．２仪器主要有Ｃａｒｙ５０紫外可见光分光光度计﹙美国Ｖａｒｉａｎ公司﹚、ＳＷ－ＣＪ－１Ｆ超净工作台﹙苏静集团安泰公司﹚、Ｎｉｋｏｎ Ｅ２００型光学显微镜＋数码显微镜系统﹙江南光电有限公司﹚、ＭＩＲ－２５４ 恒温培养箱和ＤＨＧ－９４２０Ａ电热恒温鼓风干燥箱（上海比朗仪器有限公司）等。

１．１．３培养基基本培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ ｍｅｄｉｕｍ，ＰＤＡ）；筛选培养基（叶绿素平板培养基）为ＰＤＡ培养基＋叶绿素＋琼脂。各培养基均在１×１０２ ｋＰａ下灭菌３０ ｍｉｎ。

１．１．４土壤表样采集土壤样品来源于桂林市区的七星公园、穿山公园、南溪山公园等公园内的林下表土，采样时先铲去地表的覆盖物，再铲掉０．５ ｃｍ厚的表土，然后取土壤样品。

１．２菌种筛选

分离试验采取平板稀释法［１３］，具体操作是称取土样１．００ ｇ，加入盛有２５ ｍＬ去离子水的三角瓶中，振荡１ ｍｉｎ，使土样均匀分散，配制成土壤悬浮液，静置１５ ｍｉｎ后，吸取土壤悬浮液３～５滴，滴于叶绿素平板培养基上，用涂布环涂布均匀，于３０ ℃恒温培养３～４ ｄ后检查鉴定。对于能在平板上生长的菌株继续纯培养，待长出合适的单菌落后，挑取单菌落划斜面并编号，继续在３０ ℃培养３～４ ｄ。然后从斜面上挑取菌落在叶绿素水溶液中进行发酵，进一步筛选对降解叶绿素效果更好的菌株。

１．３方法

１．３．１孢子悬浮液的制备经过叶绿素平板筛选，共计有１０株菌株能正常生长；再经过水溶液发酵复筛后，最终确定了一个降解效果好、生长较快的菌株；将筛选得到的菌株接种至ＰＤＡ斜面培养基上培养２ ｄ，在无菌条件下用去离子水洗下孢子，再用８层纱布过滤除去菌丝，制成孢子悬浮液，并定容至１００ ｍＬ，在培养箱中培养２４ ｈ后，用梯度稀释平板计数法计算悬浮液中的孢子数量，每个稀释梯度做３个平行，取平均值。

１．３．２菌株脱色能力测定采用相对值［５］表示叶绿素含量的变化。将含有叶绿素的水溶液采用Ｃａｒｙ５０紫外可见光分光光度计进行全波长扫描，找出最大吸收峰的位置，以此波长的吸光度值变化作为参考依据。在叶绿素水溶液中接入１ ｍＬ用梯度稀释平板计数法计算出孢子数量的悬浮液，经过３ ｄ的发酵，用Ｃａｒｙ５０紫外可见光分光光度计测定，计算脱色率（降解率），比较菌株的降解效果。脱色率＝ ［（Ａ０－Ａｔ）／Ａ０］×１００％。式中，Ａ０为脱色前的吸光度值，Ａｔ为脱色后的吸光度值［１４］。

１．３．３种属鉴定对经过叶绿素平板筛选、水溶液发酵复筛得到的降解效果好、生长较快的菌株，按照文献［１５］、文献［１６］的方法，在Ｎｉｋｏｎ Ｅ２００型光学显微镜＋数码显微镜系统里进行形态观察、分析，初步确定其分类地位。

１．３．４菌丝、孢子形态和菌落特征观察采用载玻片湿室培养法对经过叶绿素平板培养基筛选、水溶液发酵复筛得到的降解效果好、生长较快的菌株进行培养，在不破坏其自然生长状态的前提下，直接在显微镜下观察菌丝、孢子形态和菌落特征。载玻片湿室培养法具体操作如下：①准备湿室，在培养皿底部铺一张圆形滤纸片，滤纸片上依次放上“Ｕ”形载玻片搁架、载玻片、盖玻片（２片），盖上皿盖，外用白纸包扎，高压灭菌（１×１０２ ｋＰａ）２０ ｍｉｎ后，于ＤＨＧ－９４２０Ａ电热恒温鼓风干燥箱中６０ ℃干燥60 min，备用。②接种，用接种环将筛选得到的菌株接种到湿室的载玻片上，每张载玻片可接２点，接种时只要将带菌的接种环在载玻片上轻轻碰几下即可（接种量不要多，以免培养后菌丝过于稠密而影响观察）。③加培养基，用无菌细口滴管吸取少许熔化并冷却至４５ ℃的叶绿素平板培养基，滴加到载玻片的接种处，叶绿素平板培养基应滴得圆而薄，直径约为０．５ ｃｍ（滴加量一般以１／２小滴为宜），注意保持无菌操作。④加盖玻片，在叶绿素平板培养基未彻底凝固前，用无菌镊子将皿内的盖玻片盖在琼脂薄层上，用镊子轻压盖玻片，使盖玻片和载玻片之间的距离相当接近，但不能压扁（盖玻片不能紧贴载玻片，要彼此留有小缝隙，一是为了通气，二是使各部分结构平行排列，易于观察）。⑤倒保湿剂：每皿倒入约３ ｍＬ、２０％的无菌甘油，使皿内滤纸完全湿润，以保持皿内湿度，盖上皿盖。制成载玻片湿室，于恒温培养箱中３０ ℃培养５ ｄ。⑥观察。将培养好的载玻片取出，置于显微镜下直接观察。

１．４叶绿素降解应用试验

以ＰＤＡ培养基为底物，用发酵３ ｄ后的经过叶绿素平板培养基筛选、水溶液发酵复筛得到的降解效果好、生长较快的菌株溶液处理南宁剑麻集团提供的未去除叶绿素的剑麻麻丝，以没有用菌株液处理的未去除叶绿素的剑麻麻丝作为对照，然后在３０ ℃下１００ ｒ／ｍｉｎ振荡培养２４ ｈ，用水洗净后在显微镜下观察麻丝表面叶绿素的降解效果。

２结果与分析

２．１平板计数结果

对经过叶绿素平板筛选、水溶液发酵复筛得到的降解效果好、生长较快的菌株孢子悬浮液在恒温培养箱中培养２４ ｈ后，用梯度稀释平板计数法计算孢子数量，得到的试验数据为１．０×１０６个／ｍＬ。

２．２分类地位确定

对筛选得到的降解效果好、生长较快菌株经显微形态观察分析，鉴定为曲霉属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｍｉｃｈ．ｅｘ Ｌｉｎｋ：Ｆｒ．），并命名为ＧＬＨＺＢ３１９菌株。将该菌株送中国典型培养物保藏中心（Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＣＣＴＣＣ）保藏，保藏编号ＣＣＴＣＣ Ｎｏ：Ｍ２０１１１０１。

２．３脱色能力测定以及菌株降解效果

采用Ｃａｒｙ５０紫外可见光分光光度计测定的叶绿素水溶液最大吸光度值结果见图１。从图１可见，含有叶绿素的水溶液最大吸收峰的位置分别是６７７、６３９、４２２ ｎｍ，由此选定６７７ ｎｍ为叶绿素的吸收波长。

ＧＬＨＺＢ３１９菌株降解效果见图２。试验证明，叶绿素水溶液中接入１ ｍＬ数量为１．０×１０６个/mL的ＧＬＨＺＢ３１９菌株孢子悬浮液，经过３ ｄ的发酵，能将叶绿素水溶液的吸光度值从０．３１０降解到０．００２，降解率（脱色率）达到了９９％以上。

２．4菌丝、孢子形态和菌落特征

采用载玻片湿室培养法使ＧＬＨＺＢ３１９菌株在载玻片上自然生长，在不破坏其自然生长状态的前提下，直接在显微镜下观察菌丝、孢子形态和菌落特征，结果见图３。由图３Ａ、图３Ｂ可见，ＧＬＨＺＢ３１９菌株在ＰＤＡ培养基上３０ ℃、培养５ ｄ后，菌落直径可达６～７ ｃｍ；菌丝生长良好，为棉絮状至绒毛状；最初绿色，逐渐变为灰色，而培养基反面呈灰白色。由图３Ｃ可看出，ＧＬＨＺＢ３１９菌株的孢子梗没有分支，孢子梗顶端膨大为近似圆球状；另外在生长过程中不产生次生小柄。由图３Ｄ可见，它的分生孢子为串珠状，集中在孢子梗的上半部，散开呈扇形生长。

２．5剑麻麻丝叶绿素降解应用试验

ＧＬＨＺＢ３１９菌株液处理未去除叶绿素的剑麻麻丝的降解试验结果见图４。图４左边为剑麻叶片中抽出的麻丝，表面附有大量的叶绿素；右边为被ＧＬＨＺＢ３１９菌株作用后的麻丝。从图４中可见，ＧＬＨＺＢ３１９菌株作用后的麻丝表面干净，没有叶绿素残留，说明ＧＬＨＺＢ３１９菌株对叶绿素的降解作用是十分明显的，具有在工业上应用的价值。

３小结与讨论

试验从土壤中分离纯化出１株高效降解叶绿素的曲霉属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｍｉｃｈ．ｅｘ Ｌｉｎｋ：Ｆｒ．）菌株，命名为ＧＬＨＺＢ３１９；该菌株能以叶绿素为营养底物进行生长，对叶绿素的降解率高。目前已有部分关于微生物脱色降解染料的研究报道［１７－２０］，但利用生物工程方式降解叶绿素的报道尚未出现。而在剑麻麻丝的工艺处理上，对叶绿素的脱色主要是采用双氧水氧化法，但是双氧水脱色对麻丝的纤维分子结构有一定的破坏作用，会影响麻丝的强度；同时双氧水有化学残留，对高档剑麻纺织品有较大的负面影响，而试验得到的ＧＬＨＺＢ３１９菌株，对未去除叶绿素的剑麻麻丝的脱色作用十分明显，具有在工业上应用的价值，建议进行中间试验，以进一步完善与深入探讨ＧＬＨＺＢ３１９菌株的效用。

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