高效木质素降解菌的复合诱变选育

严平 李江

摘要：从实验室保存的９株白腐真菌中筛选出１株降解玉米秸秆木质素性能优良的菌株ＹＪ－９－１，在第１４天时，其木质素降解率为４１．７４％。经ＩＴＳ－５．８S ｒＤＮＡ序列同源性及系统发育树分析，初步鉴定该菌为变色栓菌（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）。对ＹＪ－９－１进行紫外微波复合诱变，获得1株高效木质素降解菌株３－８，并利用其对玉米秸秆中的木质素进行降解。结果表明，在第１４天时，菌株３－８对玉米秸秆木质素的降解率为４８．４３％，比出发菌株提高了１６．０３％。

关键词：白腐真菌；木质素降解；复合诱变

中图分类号：Ｑ９３３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）14－2983-05

Screening of High Efficient Lignin-Degrading Strains by Complex Mutagenesis

ＹＡＮ Ｐｉｎｇ１，ＬＩ Ｊｉａｎｇ２

（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ， Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００４１， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００４１， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｏｎｅ ｗｈｉｔｅ－ｒｏｔ ｆｕｎｇｕｓ ＹＪ－９－１ ｗｉｔｈ ｓｔｒｏｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｌｉｇｉｎ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ９ ｓｔｒａｉｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｏｌｉｄ ｓｔａｔｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ （ＳＳＦ）． Ａｆｔｅｒ １４ ｄａｙｓ ｏｆ ＳＳＦ， ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｒａｉｎ ｏｎ ｌｉｇｎｉｎ ｗａｓ ４１．７４％． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｔｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ， ＹＪ－９－１ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ａ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ． Ｕｓｉｎｇ ＹＪ－９－１ ａｓ ｓｔａｒｔｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ， ａ ｓｔｒａｉｎ ３－８ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｌｉｇｎｉｎ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ＵＶ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ． Ｔｈｅｎ strain ３－８ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｇｒａｄｅ ｌｉｇｎｉｎ ｉｎ ｃｏｒｎ ｓｔｒａｗ ｔｈｒｏｕｇｈ ＳＳＦ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｉｔｓ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｎ ｌｉｇｎｉｎ ｒｅａｃｈｅｄ ４８．４３％ ｏｎ ｔｈｅ １４ｔｈ ｄａｙ， higher than １６．０３％ ｏｆ ＹＪ－９－１．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｗｈｉｔｅ－ｒｏｔ ｆｕｎｇｕｓ； lignin-ｄｅｇｒａｄｉｎｇ； ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ

生物质是一种可再生并能转化为乙醇、生物柴油等燃料的能源物质，其中木质纤维素作为全球储存量最大的生物质，是最具前景的能源物质之一［１］。秸秆作为一种农业废弃物，是木质纤维素的重要来源，在世界各地都有着丰富的储量，仅在中国每年就有大约２亿ｔ的秸秆产出，但大部分都被直接焚烧或者丢弃，这不仅浪费资源而且造成环境污染［２］。

木质纤维素主要组分包括纤维素（３０％～５０％），半纤维素（１５％～３５％）和木质素（１０％～３０％）［３］。由于这些大分子物质的相互缠绕，木质纤维素在自然条件下很难被降解，将它转化为生物质能源则需要经过多步的处理。首先是前处理，主要去除木质素和半纤维素，目前的处理方法有物理、化学、生物以及综合处理法，其中，生物法由于环境友好、反应温和、成本低廉等优点而备受关注。

生物法中白腐真菌是目前已知的降解木质素性能最好的微生物［４］。国内外学者已在这方面进行了大量的研究，但筛选出的菌株普遍存在木质素降解率低、降解周期长等问题。如张杰等［５］筛选出1株秸秆降解白腐真菌Ｐ５，１５ ｄ后木质素降解率为１１．４７％；Zhang等［６］筛选出1株竹基质选择性降解菌Ｐｅｒｅｎｎｉｐｏｒｉａ ｓｐ．，木质素降解率只有８．６６％，而且发酵时间为４周；杜海萍［７］分离出1株糙皮侧耳菌，木质素降解率仅有１６．４１％。从实验室已有的木质素降解菌出发，通过紫外微波复合诱变筛选得到1株木质素降解率较高的白腐真菌“３－８”，在发酵１４ ｄ时木质素降解率提高到４８．４３％，该研究可为生物制浆和饲料等行业提供参考。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１菌种来源实验室保存的９株白腐真菌。

１．１．２玉米秸秆取自成都市双流县，经粉碎过４０目筛，备用。

１．１．３培养基ＰＤＡ固体培养基：去皮土豆２００.0 ｇ，葡萄糖２０.0 ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ３．０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２O １．５ ｇ，去离子水１ ０００ ｍＬ，琼脂１８.0 ｇ。初筛培养基：ＰＤＡ固体培养基＋０．０１％愈创木酚、ＰＤＡ固体培养基＋０．０１％苯胺蓝、氯化锰筛选平板（ＭｎＣｌ２·４Ｈ２Ｏ ０．１１５ ｇ， 琼脂１８.0 ｇ， 去离子水１ ０００ ｍＬ）。复筛培养基：准确称取玉米秸秆粉５．０ ｇ，装入２５０ ｍＬ的三角瓶，再加入９ ｍＬ去离子水。

１．２研究方法

１．２．１实验室木质素降解菌的筛选不同菌株经ＰＤＡ固体培养基活化后，用无菌打孔器制成直径为１ ｃｍ菌块，接入固态发酵培养基，每瓶接入两个菌块，３０ ℃恒温培养１４ ｄ后，剥去基质上菌皮，抽滤烘干后测定失重率和木质素含量，计算不同菌株对玉米秸秆木质素的降解率。

１．２．２紫外微波复合诱变

１）诱变程序。出发菌株→单孢子悬浮液的制备→紫外诱变→初筛→微波诱变→初筛→复筛→稳定性检验。

２）诱变。单孢子悬浮液的制备：用无菌水洗下斜面培养的孢子于三角瓶中，用玻璃珠充分振荡至孢子均匀分散，制成1×１０６个／ｍＬ的单孢子悬浮液。紫外诱变致死率曲线的制作：取１０ ｍＬ浓度为1×１０６个／ｍＬ的单孢子悬浮液于直径为 ９ ｃｍ的平皿内，置于紫外灯下（３０ Ｗ，距离３０ ｃｍ）分别照射２、４、６、８ ｍｉｎ。照射结束后，取不同照射时间处理的菌液各０．１ ｍＬ， 适当稀释后分别涂布于初筛培养基上，３０ ℃培养７ ｄ，计数活菌，然后以照射时间为横坐标， 致死率为纵坐标绘制致死率曲线。微波诱变致死率曲线的制作：取经紫外诱变筛选出的正突变菌株重新培养长出的孢子，制成1×１０６个/ｍＬ单孢子悬浮液，置于２０ ｍＬ厌氧管中，每管５ ｍＬ，用６００ Ｗ微波辐射１、２、３ ｍｉｎ。辐射结束后，取不同辐射时间处理的菌液各０．１ ｍＬ，适当稀释后分别涂布于初筛培养基上，３０ ℃培养７ ｄ，计数活菌，然后以辐射时间为横坐标，致死率为纵坐标绘制致死率曲线。

１．２．３诱变菌株筛选经过诱变后，从初筛培养基上挑取变色圈直径与菌落直径的比值大及显色圈色泽深的菌落，然后于复筛培养基中进行固态发酵，测定木质素降解率。

１．３测定方法

１．３．１ＤＮＡ提取及测序ＤＮＡ提取方法参考《分子生物学实验指南》［８］。DNA提取成功后，以ＩＴＳ－１（５′－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３′）和ＩＴＳ－４（５′－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３′）为引物进行ＰＣＲ扩增（反应条件：预变性９４ ℃、５．０ ｍｉｎ；变性９４ ℃、１．０ ｍｉｎ，复性５５ ℃、１．０ ｍｉｎ，延伸７２ ℃、１．５ ｍｉｎ，３５个循环；最终７２ ℃延伸１０．０ ｍｉｎ），回收纯化后的ＰＣＲ产物并连接到ＰＭＤ１９－Ｔ载体上，然后转化入大肠杆菌感受态细胞内培养，经细胞裂解确定目标片段已连接在载体上后，交由华大基因研究中心进行测序。

１．３．２系统发育树的构建将测序结果提交到美国国立生物技术信息中心（ＮＣＢＩ）ＧｅｎＢａｎｋ数据库中进行Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｌａｓｔ比对，选取同源性较高的１４株菌株ITS-5.8S rDNA序列用Ｂｉｏｅｄｉｔ软件进行Ｃｌｕｓｔａｌｗ比对，用ＭＥＧＡ软件采取邻位相邻法构建系统发育树。

１．３．３秸秆失重率、木质素降解率的计算及木质素含量的测定

木质素降解率=

失重率=

木质素含量的测定参考文献［９］采用Ｖａｎ Ｓｏｅｓｔ方法测定。

２结果与分析

２．１菌种筛选结果

经过１４ ｄ的固态发酵，各菌株对玉米秸秆木质素的降解情况见表１。其中ＹＪ－９－１和ＹＪ－６８Ｂ－１的木质素降解率超过４０.00％，分别为４１．７４％和４０．３３％，ＹＪ－９－１最高，且其于秸秆上生长时，长势较好。因此，综合来看，ＹＪ－９－１是９株菌株中降解木质素性能最优良的菌株，故选取其为目标菌株进行下一步的诱变选育。

２．２ＹＪ－９－１菌株的ＩＴＳ－５．８Ｓ ｒＤＮＡ序列分析

经测序，ＹＪ－９－１的ＩＴＳ－５．８Ｓ ｒＤＮＡ序列片段长度为６５２ ｂｐ，序列提交ＧｅｎＢａｎｋ进行核酸序列Ｂｌａｓｔ比对。选取１４株同源性较高的菌株进行系统发育树的构建，结果如图１所示。由图１可知，ＹＪ－９－１与Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ T3遗传距离最近，由此初步判定ＹＪ－９－１为变色栓菌（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）。

２．３紫外诱变时间的确定结果

按照试验方法建立的紫外诱变致死率曲线如图２所示。一般诱变时间长正突变率较高，同时负突变率也较高。因此，选择存活率为２０％左右的时间即８ ｍｉｎ作为后续紫外诱变时间。将８ ｍｉｎ诱变处理的菌液涂布于含愈创木酚的初筛培养基上，表现好的菌株接入含苯胺蓝的初筛培养基以及氯化锰筛选平板中再筛选，于３种初筛平板中都表现好的菌株，最终进入下一步的微波诱变。初筛培养基中愈创木酚的变色（变红棕色）与漆酶的产生有关，漆酶产生越多颜色越深。苯胺蓝的脱色与木质素过氧化物酶及锰过氧化物酶的产生有关，木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶越多脱色越快，脱色圈也就越大。氯化锰的变色（变红棕色）与锰过氧化物酶的产生有关，锰过氧化物酶产生越多颜色越深。漆酶、木质素过氧化物酶及锰过氧化物酶被公认为是木质素降解的关键酶，白腐真菌就是靠分泌这些酶来降解木质纤维素从而获得生存所需的碳源和能源［１０］。

诱变菌在初筛培养基上的表现好坏是通过测定变色圈直径与菌落直径的比值大小及观察变色圈的深浅来判定的。２批紫外诱变后，在初筛菌株中发现３株菌株的变色圈直径与菌落直径的比值和变色圈色泽均优于出发菌株。因此，这３株菌进入接下来的微波诱变。

２．４微波诱变时间的确定结果

按照试验方法建立的微波诱变致死率曲线见图２。选择致死率为８０％左右的时间即１ ｍｉｎ作为后续微波诱变时间。紫外诱变选出的３株菌株经过３批微波诱变后初筛，发现其中６株菌株的变色圈直径与菌落直径的比值和变色圈色泽均优于出发菌株（表２）；并且，变色圈初筛结果还表明，该６株菌株的变色圈直径／菌落直径的比值明显大于经单一诱变的菌株，且变色圈颜色也比其他突变株更深，因此选择它们进入固态发酵的复筛试验。复合诱变常常具有明显的协同诱变效果，虽然伴随着致死率的增加（与单一诱变相比），但从中获得某一方面遗传特性大幅度提高的诱变菌株的可能性也大大增加。从表２中还可看出，３种初筛培养基中几乎所有菌株在氯化锰筛选平板上的生长状况都很差，菌株不仅长得慢，而且产生的变色圈也很小，但是，不同的菌株在氯化锰筛选平板上的表现还是有较为明显的不同，如菌株３－１可以长满整个氯化锰筛选平板，而其他菌株的菌丝圈直径大多不超过５．０ ｃｍ。但是菌株３－１在氯化锰筛选平板上的变色圈却小于菌株３－８。同类研究中，一般较少使用氯化锰筛选平板，但从此次的试验结果可看出氯化锰筛选平板可以作为木质素降解菌诱变的初筛培养基。

２．５玉米秸秆固态发酵进行复筛的结果

将分离出的６株白腐真菌菌株以玉米秸秆为基质进行复筛。在３０ ℃下培养１４ ｄ，复筛结果见表３。由表３可知，６株菌株中，菌株３－８的木质素降解率最高，１４ ｄ达到４８．４３％，比出发菌株提高了１6．03％。并且在接下来的稳定性试验中（３次重复的固态发酵），其木质素降解率都保持在４８．００％左右。固态发酵全过程中，菌株３－８的菌丝生长均较出发菌株快，这为其高的木质素降解率提供了前提条件，同时也表明，快的菌丝生长速度与高的木质素降解率密切相关。其他５株菌株虽然在初筛培养基中表现较好，但在复筛时，木质素降解率却没有提高，这从某种程度上说明初筛只是很粗略的筛选，不能正确体现诱变菌的潜力，只有当初筛与复筛结合，才能既避免初筛的不确定性，又免去直接进入复筛的费时费力。

３结论

从实验室保存的白腐真菌中筛选出１株木质素降解率较高的菌株ＹＪ－９－１，在培养１４ ｄ时，其木质素降解率为４１．７４％。经ＩＴＳ－５．８Ｓ ｒＤＮＡ序列分析，初步鉴定为变色栓菌（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）。

对ＹＪ－９－１进行紫外-微波复合诱变，根据致死率曲线，紫外诱变选取致死率８０％左右的时间８ ｍｉｎ，微波诱变选取致死率８０％左右的时间１ ｍｉｎ，２批紫外诱变后初筛得到３株突变菌株，再将其进行微波诱变，初筛后得到６株突变菌株，然后对它们进行玉米秸秆固态发酵的复筛，得到1株木质素降解率提高１6．03％的菌株３－８，１４ ｄ的固态发酵后，其木质素降解率达到４８．４３％；在３次重复的固态发酵试验中，稳定性较好，木质素降解率保持在４８．００％左右。试验结果表明，复合诱变能将单独诱变的效果协同起来，达到更优的诱变效果。

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