解脲脲原体喹诺酮类药物耐药机制的研究

张一沙 吴颖 范兴丽 蒋锦琴 孙爱华

[摘要] 目的 研究解脲脲原体喹诺酮类药物耐药机制。 方法 用支原体培养、鉴定和药敏试剂盒分离获得77株解脲脲原体并检测对3种喹诺酮类药物的耐药性，同时PCR法扩增临床分离株的gyrA和parC基因喹诺酮耐药决定区并进行测序分析。 结果 对3种喹诺酮均敏感3株，74株至少对1种药物呈现不同程度耐药。gyrA和parC基因喹诺酮耐药决定区测序发现上述敏感株和2株耐药株不发生突变，其余72株耐药株gyrA和parC发生D112E和/或S83L突变。 结论 解脲脲原体gyrA和parC基因喹诺酮耐药决定区突变与耐药密切相关。

[关键词] 解脲脲原体；gyrA、parC基因；突变；序列分析；耐药性

[中图分类号] R446.5[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701（2012）16-0001-03

To study of resistance mechanisms of Ureaplasma urealyticum to quinolones

ZHANG Yisha1 WU Ying2 FAN Xingli3 JIANG Jinqin3 SUN Aihua3

1.Department of Urological Surgery, Taizhou Integrative Medicine Hospital in Zhejiang Province, Wenling 317523, China; 2.Department of Clinical Laboratory, Taizhou Integrative Medicine Hospital in Zhejiang Province, Wenling 317523, China; 3.Department of Basic Medicine, Zhejiang Medical College, Hangzhou 310053, China

[Abstract] Objective To study the resistance mechanisms of Ureaplasma urealyticum to quinolones. Methods Mycoplasma detection kits were used to culture and identify mycoplasma as well as drug sensitivity. PCR and DNA sequencing were conducted to analyze QRDR associated genes of gyrA and parC in 77 isolates. Results There were only 3 isolates susceptible to all quinolones, and 74 isolates showed varying degree resistance to at least one kind of quinolone. Sequencing analysis of gyrA and parC revealed that 3 susceptible isolates and 2 resistant isolates had no mutation, 72 resistant isolates had mutation of D112E and/or S83L in gyrA and parC. Conclusion Mutations in gyrA and parC genes play an important role in the development of quinolones resistance in Ureaplasma urealyticum.

[Key words] Ureaplasma urealyticum; GyrA and parC genes; Mutation; Sequence analysis; Drug resistance

慢性前列腺炎是男性最常见的泌尿生殖道疾病之一，解脲脲原体（Ureaplasma urealyticum，Uu）是引起非细菌性慢性前列腺炎的主要病原体[1]。喹诺酮类药物是一类人工合成的具有高效广谱抗菌作用的药物。随着喹诺酮类药物的大量和广泛的应用，解脲脲原体临床分离株对该类药物的敏感性逐渐下降并出现耐药[2-5]。

国内外对解脲脲原体对喹诺酮类药物的耐药机制研究不多，喹诺酮类药物的作用靶酶为Ⅱ型拓扑异构酶（包括DNA螺旋酶和拓扑异构酶Ⅳ），喹诺酮类药物耐药是由于编码靶酶的基因突变导致靶酶的氨基酸序列改变，gyrA和parC基因分别编码DNA螺旋酶和拓扑异构酶Ⅳ，GyrA和ParC氨基酸发生替换突变抑制细菌DNA螺旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的活性导致耐药[6]。本研究从慢性前列腺炎患者前列腺液中分离了77株解脲脲原体并检测其对3种喹诺酮类药物的耐药性，PCR扩增所有菌株gyrA和parC基因包括喹诺酮耐药决定区（quinolone resistance determining regions，QRDR）在内的核苷酸序列并直接测序，以探讨本地区分离自非细菌性慢性前列腺炎解脲脲原体gyrA和parC基因的QRDR突变与喹诺酮类药物耐药的相关性。

1 材料与方法

1.1 前列腺液的采集

采集2008年6月～2011年10月本院泌尿外科门诊拟诊断为慢性前列腺炎患者的前列腺液。用生理盐水清洁龟头和尿道口后用碘伏消毒，直肠指诊按摩前列腺，获取前列腺液，用无菌拭子洗脱于无菌的EP管中，用于培养或PCR研究。血清3型解脲脲原体标准株ATCC700970来自浙江大学病原生物系。

1.2 支原体分离与鉴定及药敏试验

支原体鉴定及药敏试验一体化试剂盒由珠海黑马生物工程有限公司生产，取无菌拭子洗脱液，按试剂盒说明书操作，与生长对照孔比较，培养24 h后Uu孔由黄色变为橙色或红色且未见浑浊为阳性，表示有Uu生长，不变色表示阴性。筛选获得77株解脲脲原体菌株，-70℃保存。

1.3 药敏试验结果判断

支原体鉴定药物环丙沙星、氧氟沙星和司帕沙星3种药物高、低两个浓度各设1孔，均不变色表示敏感，都变红色表示高度耐药，低浓度孔变红色、高浓度孔不变色表示低度耐药。

1.4 DNA模板的制备

取上述细菌株培养物500 μL，6 000 r/min离心10 min，沉淀中加入25 μL细菌裂解液，充分混匀后沸水浴10 min，10 000 r/min离心10 min，取2 μL上清作为PCR的DNA模板。

1.5 引物设计

参考GenBank登录血清3型解脲脲原体gyrA和parC基因参考序列（GenBank：AF222894.1）及QRDR位置设计上、下游引物。gyrA基因上游引物序列：5-GCT GCT TTC GAA AAC GGA ATG-3，下游引物序列：5''-TGA TGG TAA AAC ACT TGG AAC-3。parC基因上游引物序列：5-GAC GAA TTT TAT ACG CAA TG-3，下游引物序列：5''-TTT CAC TAT CAT CAA AGT TTG-3。委托上海Invitrogen公司测序合成引物。

1.6 PCR扩增及扩增产物检测

PCR总体积为100 μL，内含2.5 mol/L各dNTP、250 nmol/L各引物、2.5 U Ex-Taq DNA聚合酶（TaKaRa）、5 μL DNA提取物为模板、1×PCR缓冲液（pH8.3）。PCR参数：94℃ 4 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 5 min。采用1 μg/mL溴乙锭预染色的2.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，扩增产物包括gyrA和parC基因QRDR的区域预期大小分别为333 bp和324 bp。

1.7 核苷酸序列测定及分析

采用BioColor公司的3S柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒提纯，委托Invitrogen公司测定PCR纯化产物gyrA和parC基因片段的核苷酸序列。参照已报道的血清3型解脲脲原体标准株ATCC700970 gyrA和parC基因核苷酸序列及推测的氨基酸序列进行比较，以确定上述菌株gyrA和parC基因QRDR的突变情况。

1.8 统计学处理

实验数据采用χ2检验，对检测结果进行比较，P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药敏结果

77株解脲脲原体对3种喹诺酮类药物的药敏试验结果见表1。除3株对3种喹诺酮类药物均敏感外，其余74株至少对1种药物呈现不同程度的耐药，其中对药物只呈现低度耐药的有26株，至少对1种药物高度耐药的有48株。

2.2 PCR扩增结果

利用自行设计的引物扩增77株解脲脲原体的gyrA和parC基因目的片段，2.0%琼脂糖凝胶电泳显示所有77株解脲脲原体PCR产物在294 bp和237 bp位置有gyrA和parC基因扩增的目的片段。同样条件下血清3型解脲脲原体标准株ATCC700970 PCR扩增结果为阳性，见图1。

2.3 PCR测序结果

77株菌株gyrA和parC基因目的片段PCR测序结果与血清3型标准株ATCC700970对应序列比较见表1，对3种喹诺酮类药物均敏感菌株gyrA和parC基因测定序列与标准菌株对应序列完全相同，gyrA基因c336a（D112E）和parC基因c248t（S83L）均不发生突变；74株至少对1种药物发生耐药的菌株中，只有2株上述基因对应位置不发生突变，其余72株都存在gyrA基因c336a（D112E）和/或parC基因c248t（S83L）突变，两者比较差异有统计学意义（χ2=45.0，P ＜ 0.05）。74株至少对1种药物发生耐药的菌株中，26株至少对1种药物呈现低度耐药，其中1株gyrA和parC基因测定序列与标准菌株对应序列完全相同，gyrA基因c336a（D112E）和parC基因c248t（S83L）均不发生突变，20株只发生gyrA基因c336a（D112E）或parC基因c248t（S83L）单位点突变，只有5株gyrA和parC基因上述位点突变同时突变；48株至少对1种药物呈现高度耐药，其中除1株gyrA和parC基因上述位点均不发生突变外，发生gyrA基因c336a（D112E）或parC基因c248t（S83L）单位点突变的只有13株，34株gyrA和parC基因上述位点突变同时发生，不同耐药程度的解脲脲原体gyrA基因c336a（D112E）和parC基因c248t（S83L）双突变发生率差异有统计学意义（χ2=18.6，P ＜ 0.05）。

3 讨论

支原体没有固定的细胞壁，部分针对细菌细胞壁合成的抗生素如β-内酰胺类、万古霉素等完全不敏感，目前治疗支原体感染主要有四环素类、大环内酯类和喹诺酮类，其中喹诺酮类药物是一类人工合成的广谱抗生素，具有对解脲脲原体抗菌活性强且能口服、与其他药物交叉耐药少、毒副作用少等特点而广泛应用。

喹诺酮类药物的作用靶酶是Ⅱ型拓扑异构酶（包括DNA螺旋酶和拓扑异构酶Ⅳ），在支原体繁殖传代中DNA的复制过程，通过抑制细菌DNA螺旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的活性达到抗菌目的[5，6]。gyrA和parC基因分别编码DNA螺旋酶和拓扑异构酶Ⅳ，基因上的一段与喹诺酮类耐药相关的核苷酸序列被称为喹诺酮耐药决定区，其中gyrA基因5末端第202～531位碱基（即编码GyrA第68～177位氨基酸残基的碱基）和parC基因5末端第152～456位碱基（即编码GyrA第51～152位氨基酸残基的碱基）组成各自的QRDR区，QRDR区碱基突变导致编码的氨基酸突变抑制细菌DNA螺旋酶或拓扑异构酶Ⅳ的活性导致耐药[6]。其中最主要的是与gyrA和parC基因编码蛋白GyrA和ParC空间结构密切相关的D112和S83氨基酸突变[3-5，6]。本研究发现对3种喹诺酮类药物都敏感的3株菌株GyrA和ParC氨基酸编码与解脲脲原体血清3型标准株序列完全相同，gyrA基因c336a（D112E）和parC基因c248t（S83L）测定区域均不发生突变，74株至少对1种药物发生耐药的菌株中，只有2株上述基因对应位置不发生突变，两者比较有显著性差异，提示gyrA基因c336a（D112E）和/或parC基因c248t（S83L）突变是否发生与喹诺酮类药物敏感性密切相关。74株至少对1种药物发生耐药的菌株中，48株至少对1种药物呈现高度耐药，其中34株gyrA基因c336a（D112E）和parC基因c248t（S83L）突变同时发生，而26株至少对1种药物呈现低度耐药，其中只有5株gyrA基因c336a（D112E）和parC基因c248t（S83L）突变同时发生，统计结果表明对喹诺酮类药物不同耐药程度的解脲脲原体gyrA基因c336a（D112E）和parC基因c248t（S83L）双突变发生率差异有统计学意义，提示双突变与喹诺酮类耐药程度密切相关。另我们在研究中发现有2株耐药株gyrA基因存在c302u（A101V）突变，其中1株不伴有gyrA基因c336a（D112E）或parC基因c248t（S83L）突变。另有2株高度耐药株parC基因编码蛋白ParC存在125位T125A突变，为国内首次报道。

[参考文献]

[1]Hartmann M. Genital mycoplasmas[J]. J Dtsch Dermatol Ges，2009，7（4）：371-377.

[2]Zhang W，Wu Y，Yin W，et al. Study of isolation of fluoroquinolone-resistant Ureaplasma urealyticum and identification of mutant sites[J]. Chin Med J，2002，115（10）：1573-1575.

[3]Bébéar CM，Renaudin H，Charron A，et al. DNA gyrase and topoisomerase IV mutations in clinical isolates of Ureaplasma spp. and mycoplasma hominis resistant to fluoroquinolones[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2003，47（10）：3323-3325.

[4]Xie X，Zhang J. Trends in the rates of resistance of Ureaplasma urealyticum to antibiotics and identification of the mutation site in the quinolone resistance-determining region in Chinese patients[J]. FEMS Microbiol Lett，2006，259（2）：181-186.

[5]Beeton ML，Chalker VJ，Kotecha S，et al. Comparison of full gyrA, gyrB, parC and parE gene sequences between all Ureaplasma parvum and Ureaplasma urealyticum serovars to separate true fluoroquinolone antibiotic resistance mutations from non-resistance polymorphism[J]. J Antimicrob Chemother，2009， 64（3）：529-538.

[6]Chen FJ，Lo HJ. Molecular mechanisms of fluoroquinolone resistance[J]. J Microbiol Immunol Infect，2003，36（1）：1-9.

（收稿日期：2012-03-22）