陕北果树根际解磷菌的初步研究

2012-04-29高小朋景斌斌贺晓龙任桂梅

湖北农业科学 2012年18期

关键词：陕北

高小朋景斌斌贺晓龙任桂梅

摘要：试验利用ＰＫＯ培养基从陕北果树根际土壤中筛选得到４株可有效分解利用难溶性磷酸盐的菌株，对其解磷及促植物生长能力进行了研究。结果表明，试验菌株在利用无机磷的同时，可产生有机磷、ＮＨ３和ＨＣＮ，可有效促进植物的生长。试验可为陕北果树专用菌肥的开发、生产打下基础。

关键词：果树根际；解磷菌；代谢产物；陕北

中图分类号：Ｓ１５４．３９文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）18－3961-02

Preliminary Research of Phosphorus-Degrading Strains in Rhizosphere of Fruit Trees in Northern Shaanxi

ＧＡＯＸｉａｏ－ｐｅｎｇ，ＪＩＮＧＢｉｎ－ｂｉｎ，ＨＥＸｉａｏ－ｌｏｎｇ，ＲＥＮＧｕｉ－ｍｅｉ

（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＹａｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎａｎ７１６０００，Ｓｈａａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＦｏｕｒｓｔｒａｉｎｓｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｄｅｇｒａｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｏｆｆｒｕｉｔｔｒｅｅｓｉｎｎｏｒｔｈｅｒｎＳｈａａｎｘｉｂｙＰＫＯｍｅｄｉｕｍａｎｄｔｈｅｉｒａｂｉｌｉｔｉｅｓｉｎｄｅｇｒａｄｉｎｇｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓａｎｄｐｒｏｍｏｔｉｎｇｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅｓｅｓｔｒａｉｎｓｃｏｕｌｄｐｒｏｄｕｃｅｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ，ＮＨ３ａｎｄＨＣＮ，ａｎｄｃｏｕｌｄｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｐｌａｎｔｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｌａｉｄａｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｍａｎｕｒｅｆｏｒｆｒｕｉｔｔｒｅｅｓｉｎｎｏｒｔｈｅｒｎＳｈａａｎｘｉ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｏｆｆｒｕｉｔｔｒｅｅｓ；ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇｓｔｒａｉｎｓ；ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ

磷素是植物生长的重要养分因子，但是由于施入土壤的大部分磷与土壤中的Ｃａ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋等结合形成难溶性磷酸盐，成为生物低效磷［１］。研究表明，解磷微生物可以分泌有机酸，有机酸与土壤中的Ｃａ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋等离子反应，从而使ＰＯ４３＋释放出来，有助于植物对磷素的吸收［２，３］。大部分解磷菌均属于根际微生物，由于受土壤物理结构、有机质含量、土壤类型、土壤肥力、耕作方式等因素的影响，在数量上存在较大差异。研究从陕北苹果树、枣树根际土壤中分离筛选高效解磷菌，并对其解磷及促植物生长能力进行研究，以期为陕北苹果树、枣树专用菌肥的研制生产打下基础。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１供试土样试验所用土样分别采自陕北洛川县苹果园和延川县枣园。

１．１．２试剂ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ（分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司）、ＨｇＣｌ２（分析纯，贵州省铜仁化学试剂厂）、ＫＩ（分析纯，天津天锋化学品有限公司）、氨基乙酸（甘氨酸，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）、２，４，６—三硝基苯酚（分析纯，广州台山粤侨试剂有限公司）、Ｎｅｓｓｌｅｒｓ试剂［4］。

１．１．３仪器ＵＶ－１２４０紫外可见分光光度计（日本岛津）、立式压力蒸汽灭菌锅（ＬＳ－Ｂ５０Ｌ，江阴滨江医疗设备厂）、隔水式电热恒温培养箱（ＰＹＸ－ＤＨＳ－４０×５０－ＢＳ，上海跃进医疗器械厂）、超净工作台（苏净集团安泰公司）、汽浴式振荡器（ＺＪＳ－１３２０，科大创新股份有限公司中佳分公司）等。

１．１．４培养基ＰＫＯ培养基［5］、ＬＢ培养基、蛋白胨水培养基、ＮＢ培养基［6］。

１．２方法

１．２．１解磷菌的筛选①初筛。取土样进行高倍稀释，稀释液涂布于ＰＫＯ平板上，２８ ℃培养７ｄ后，可在平板上产生透明圈的即为解磷菌，划线法分离得到单菌落，４ ℃保存备用。②复筛。复筛主要测定初筛得到菌株解磷能力的稳定性［7］。将初筛得到的解磷菌接种于ＬＢ固体培养基上，每２４ｈ转接１次，连续转接２０次后，在ＰＫＯ平板上菌落周围仍可产生透明圈的为具有稳定解磷能力的解磷菌，将其作为下一步的试验菌株，４ ℃保存备用。

１．２．２试验菌株解磷能力的测定①解磷效果的定性测定。取复筛得到的试验菌株，接种于加溴甲酚紫的ＰＫＯ平板上，２８ ℃培养８ｄ，测定解磷圈直径（Ｄ）和菌落直径（ｄ），根据Ｄ／ｄ的大小来确定其解磷能力。②解磷效果的定量测定［8－１1］。取定性测定的解磷能力较强的试验菌株，接种于ＬＢ液体培养基中，于２８ ℃、１８０ｒ／ｍｉｎ活化２４ｈ，取活化后的菌液以１０％的接种量接入ＰＫＯ培养基中，２８ ℃、１８０ｒ／ｍｉｎ培养，每隔１ｄ用磷钼蓝比色法［１2］测定培养液中有机磷的含量，连续测定，确定试验菌株对无机磷的分解情况。

１．２．３试验菌株代谢产物的定性测定［１3］①ＨＣＮ的测定。将试验菌株划线接种于添加了４．４ｇ／ｍＬ甘氨酸的ＮＢ平板上，另将浸过２％碳酸钠、０．５％苦味酸溶液（２，４，６—三硝基苯酚）的滤纸置于培养基上，密封，２８℃、４ｄ后，滤纸颜色由橘黄色变为红色的说明有ＨＣＮ产生。②ＮＨ３鉴定。将试验菌株以２％接种量接入蛋白胨水培养基中，２８ ℃、４８～７２ｈ培养，加入Ｎｅｓｓｌｅｒｓ试剂后，颜色由褐色变为黄色的表明有ＮＨ３产生。

２结果与分析

２．１解磷菌分离纯化结果

经过ＰＫＯ平板的初步筛选，共分离到２０株解磷菌，分别编号为ＢＭ－１至ＢＭ－２０，经过复筛，有１３株菌的解磷能力丧失。这可能是一部分解磷菌的解磷能力是对环境中的磷素的一种适应性表达，当环境中磷素减少或缺失时，其解磷能力也随之消失。选择剩余的４株菌（ＢＭ－１、ＢＭ－５、ＢＭ－６、ＢＭ－１５）作为下一步的试验菌株。

２．２试验菌株解磷能力的测定结果

２．２．１解磷能力定性测定结果各试验菌株在加溴甲酚紫的ＰＫＯ平板上的菌落及透明圈的直径大小见表１。由表１可知，4株试验菌株中，菌株ＢＭ－１５的解磷能力最强，菌株ＢＭ－６的解磷能力较弱。还需对４株试验菌株进行后续解磷能力的定量测定。

２．２．２解磷能力的定量测定４株解磷能力较强的菌株９ｄ内使培养液中有机磷含量发生变化，其具体情况见图１。由图１可知，经菌株ＢＭ－１、ＢＭ－５、ＢＭ－１５作用，从第一天到第七天，培养液中的有机磷含量呈增加趋势，到第七天达到最高值，分别为３．３３０、３．０４６、３．０５６ μｇ／ｍＬ，而菌株ＢＭ－６是在培养了８ｄ时培养液中有机磷的含量达到最大为３．４８４ μｇ／ｍＬ，这说明试验菌株在代谢过程中，可将难溶性磷酸盐有效地分解利用，转化成有机磷。

２．３试验菌株代谢产物的测定结果

２．３．１试验菌株产ＨＣＮ的测定结果培养４ｄ后，４株试验菌株所生长的培养基上滤纸的颜色均由橘黄色转为红色，说明４株解磷菌均产生了ＨＣＮ。

２．３．２试验菌株产ＮＨ３的测定结果４株试验菌株在蛋白胨水培养基中培养２～３ｄ，加入Ｎｅｓｓｌｅｒｓ试剂后，培养液颜色均由褐色转为黄色，说明４株试验菌株均可产ＮＨ３。

３小结与讨论

１）试验经过筛选得到４株高效解磷菌，４株试验菌株在分解利用难溶性磷酸盐的同时还可产生有机磷、ＨＣＮ和ＮＨ３，促进植物生长。

２）４株试验菌株可以有效地利用难溶性无机磷，产生有机磷、ＨＣＮ和ＮＨ３，为菌肥的生产打下了基础。这是由于解磷微生物产生的ＨＣＮ可以抑制病原菌的繁殖，ＮＨ３和其他代谢产物不仅能刺激植物快速生长，还可提高根际酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性，减少根系有机酸、磷酸酶等物质的分泌，在很大程度上减轻了植物由于营养缺乏而导致的根际酸化现象［１4，１5］。

３）４株试验菌株可作为解磷优势菌。然而，解磷菌分解难溶性磷的能力，除了受菌株遗传特性的影响外，还和其生长条件和环境有关。解磷菌一般对环境中的磷素有一个适应性表达的过程，所以，要确定这些菌株在陕北果区土壤中的定殖和生存能力以及实际解磷促生的效果还需深入研究。

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