黄瓜(Cucumis sativus L.)花药培养

Nguyen Thi Thanh Van 陈劲枫

摘 要： 以卡罗尔、HH1-8-57与津绿农家乐3个不同基因型黄瓜品种为试材，在Kumar 等、Song 等和詹艳等试验研究基础上，设计试验分别探讨低温预处理时间、培养基成分（胚性愈伤组织诱导培养基、胚状体诱导培养基）和基因型等因素对黄瓜花药培养的影响。结果表明：在4 ℃ 低温预处理2 d时，胚性愈伤组织诱导率显著高于其他处理；在MS■1.0 mg·L-1 2，4-D ■ 0.5 mg·L-1 6-BA ■ 3% 蔗糖 ■ 0.8% 琼脂培养基上胚性愈伤组织诱导率最高，达到81.3%；在MS ■ 0.1 mg·L-1 NAA ■ 3.0 mg·L-1 6-BA ■ 3% 蔗糖 ■ 0.8% 琼脂培养基上胚状体诱导率最高，为40.0%；基因型间胚性愈伤组织诱导率及胚状体诱导率差异显著，津绿农家乐品种胚性愈伤组织诱导率最高，达到81.1%，HH1-8-57胚状体诱导率最高，为40.0%。本研究从2份试材中成功地诱导出胚状体并获得了黄瓜单倍体再生植株。

关键词： 黄瓜； 花药培养； 胚性愈伤组织； 胚状体； 再生植株

Cucumber （Cucumis sativus L.） Anther Culture

Nguyen Thi Thanh Van， CHEN Jin-feng

（State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement， College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing，Jiangsu， 210095， China）

Abstract： Based on the protocols by Kumar et al，Song et al and Zhan，the anthers of three cucumbers genotypes“Kaluoer”，“HH1-8-57”and“Jinlu Nongjiale” were used as test materials to investigate the factors of anther pretreatment（temperature and duration），medium composition（embryonic callus induction medium and embryo induction medium） and cucumber genotype on cucumber anther culture. The results showed that pretreatment of anthers at 4 ℃ for 2 d significantly increased the embryonic callus induction ratio；the highest rate（81.3%）of embryonic callus induction was obtained on Zhans medium（MS + 1.0 mg·L-1 2，4-D + 0.5 mg·L-1 6-BA + 3% sucrose + 0.8% agar）；the highest rate（40.0%） of embryoids induction was obtained on Songs embryo induction medium（MS + 0.1 mg·L-1 NAA + 3.0 mg·L-1 6-BA + 3% sucrose + 0.8% agar）. The embryonic callus and embryoid induction ratios were significantly different among tested varieties. Variety“Jinlu Nongjiale” had the highest embryonic callus induction rate（81.1%）and“HH1-8-57”had the highest embryoid induction rate（40.0%）. Embryogenesis and haploid plants were obtained from two of three tested genotypes.

Key words： Cucumber； Anther culture； Embryonic callus； Embryoid； Plant regeneration

黄瓜（Cucumis sativus L.）是葫芦科重要的经济作物。采用常规育种手段选育新品种不仅耗时耗力、效率低，且难以使新品种在抗性和品质等方面有显著提高。利用花药培养技术可快速获得纯系和突变体，将大大缩短育种时间，同时也为分子理论研究提供基础。

有关黄瓜花药培养研究目前在国内外报道较少。Lazarte和Sasser[1]首次从黄瓜花药培养中获得愈伤组织，但没有说明愈伤组织的来源是配子体还是孢子体。Kumar等[2-3]以及詹艳[4]对几个黄瓜品种进行花药培养，诱导胚胎发生并获得了单倍体再生植株。Song等[5]通过黄瓜花药培养获得了双单倍体。本文是在Kumar 等[2]、詹艳[4]和Song等[5]试验研究的基础上，从胚性愈伤组织诱导培养基、4 ℃ 低温预处理时间、胚状体诱导培养基等方面设计试验，研究其对黄瓜花药培养的影响，确定最适宜的花药培养条件，为建立黄瓜花药培养及植株再生体系提供理论和技术基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以卡罗尔、HH1-8-57与津绿农家乐作为供体材料，将其种植于南京农业大学园艺试验站塑料大棚中，常规管理。

1.2 花药培养方法

于盛花期，在晴天 9 : 00—10 : 00选择健壮植株，取小孢子发育处于单核靠边期的花蕾。将花蕾放置于铺有湿纱布的培养皿中，然后置于4 ℃下预处理2 d。接种前先将花蕾用流水冲洗30 s，然后用70% 酒精消毒30 s，再用0.1% 升汞消毒8 min，最后用无菌水冲洗3次，每次30~60 s。花蕾消毒之后，于超净工作台上，用镊子和解剖针小心剥取花蕾中的5个花药，去除花丝，接种到盛装30 mL 固体胚性愈伤组织诱导培养基的培养皿（90 mm×15 mm）内，然后置于25 ℃ 下暗培养2周产生胚性愈伤组织。再将其转接至胚状体诱导培养基上，在25 ℃ 恒温条件下培养20 d左右，每天进行16 h光照培养，以获得胚状体。之后胚状体在胚状体萌发培养基（MS ■ 0.5 mg·L-1 6-BA ■ 6.0% 蔗糖 ■1.2% 琼脂）上培养20 d左右，使其萌芽并形成苗。将无根苗以及根较弱的再生植株转接至生根培养基（1/2 MS■0.2 mg·L-1 IBA■ 3% 蔗糖■ 0.8% 琼脂）上进行光照培养，15 d左右即可获得大量的根，形成完整的再生植株。

1.3 各因素对花药培养的影响试验

1.3.1 不同胚性愈伤组织诱导培养基对胚性愈伤组织诱导的影响 每个参试材料取70个花蕾，4 ℃ 低温预处理1 d。然后接种到不同胚性愈伤组织诱导培养基（表1）上。接种密度为每个培养皿25个花药，每种培养基接种3个培养皿，作为3次重复。暗培养2周以后，统计胚性愈伤组织诱导率，要求分化出的胚性愈伤组织直径在0.2 cm以上。公式如下：

胚性愈伤组织诱导率/%=（产生胚性愈伤组织花药数量/接种花药数量）×100

表1 3种胚性愈伤组织诱导培养基成分

[注] （1）Kumar的培养基；（2）Song的培养基；（3）詹艳的培养基。表 2同。

1.3.2 4 ℃ 低温预处理不同时间对黄瓜花药胚性愈伤组织诱导率的影响 每个参试材料取80个花蕾，随机分作4组，分别于4 ℃ 下预处理0 d、1 d、2 d和4 d。花蕾预处理完毕，基于试验1的结果，将其接种到3号胚性愈伤组织诱导培养基上。接种密度为每个培养皿25个花药，每个处理接种3个培养皿，作为3次重复。在暗室培养2周后，统计胚性愈伤组织诱导率。

1.3.3 不同胚状体诱导培养基对胚状体诱导的影响

将之前试验获得的胚性愈伤组织，接种到不同的胚状体诱导培养基（表2）上。每个培养皿接种 15块胚性愈伤组织，每种培养基接种3个培养皿，作为3次重复。光照培养培养20 d后，统计胚状体诱导率。

胚状体诱导率/%=[（产生胚状体的胚性愈伤组织数量/接种胚性愈伤总数量）× 100]

表2 3种胚状体诱导培养基成分

1.3.4 不同基因型对黄瓜花药培养的影响 每个材料各取18个花蕾，基于之前试验的结果进行培养成苗和形成完整的再生植株。统计每个基因型的胚性愈伤组织诱导率、胚状体诱导率。

以上试验所需培养基均利用1 mol·L-1 HCl和1 mol·L-1 NaOH调节pH值为5.8，培养基采用高压蒸汽灭菌，温度为（121±1）℃，灭菌时间 20 min。

1.4 再生植株倍性鉴定

将再生植株在生根培养基上培养15 d后，从培养瓶中随机选取20株，取根尖，参照李懋学等[6]的方法，稍作改动进行染色体计数：将根尖在室温下先用0.075 mol·L-1的饱和对二氯苯处理3 h，然后用0.075 mol·L-1的KCl溶液处理30 min，最后在醋酸酒精（醋酸 ∶ 酒精=1 ∶ 3）溶液里固定24 h。用去离子水将处理好的根尖洗净，而后在60 ℃下于1 mol·L-1 HCl中解离12 min，卡宝染色1 h，最后用45%乙酸压片在OLYMPUS（BX51）显微镜下镜检。

1.5 数据统计分析

采用SAS软件统计分析相关数据，Duncans多重比较法进行显著性测验分析。

2 结果与分析

2.1 黄瓜花药培养胚胎发生情况

黄瓜花药在胚性愈伤组织诱导培养基（MS ■ 1.0 mg·L-1 2，4-D ■ 0.5 mg·L-1 6-BA ■ 3.0%蔗糖 ■ 0.8% 琼脂）上生长1周后，有些花药对诱导没有反应，很快褐化死亡，但有些花药体积缓慢增大，并且颜色由刚接种时的黄色和黄绿色逐渐加深为深黄色和绿色（图1-A）。之后愈伤组织不断增殖，培养2周后，可见由彼此不相连且表面有很多突起的颗粒状结构组成的淡黄绿色胚性愈伤组织（图1-B）。部分胚性愈伤组织已带有球形胚（图1-C）。胚状体或带有胚状体的胚性愈伤组织不能在胚性愈伤组织诱导培养基上进一步分化。因此将胚性愈伤组织（包括带有胚状体的胚性愈伤组织）转接至胚状体诱导培养基（MS + 3.0 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA + 3.0% 蔗糖 + 0.8% 琼脂）上，培养20 d后可见成熟的子叶形胚（图1-D）。之后将子叶形胚转移至胚状体萌发培养基（MS + 0.5 mg·L-1 6-BA + 6.0% 蔗糖 + 1.2% 琼脂）上，培养20 d后，大部分子叶形胚可形成根、叶、芽俱全的完整植株，部分子叶形胚根发育不良形成无根苗（图1-E1、E2），经生根培养基培养后生根（图1-F）。

2.2 不同胚性愈伤组织诱导培养基对胚性愈伤组织诱导的影响

在植物花药培养中诱导花粉细胞由配子体途径转化为孢子体途径，形成体细胞胚胎的过程中，外源生长素和细胞分裂素是必不可少的诱导条件。如表3所示，3号胚性愈伤组织诱导培养基诱导胚性愈伤组织效果最佳，卡罗尔、HH1-8-57和津绿农家乐的平均诱导率分别达到56.0%、73.7% 和77.3%。1号培养基诱导胚性愈伤组织效果最低，卡罗尔、HH1-8-57和津绿农家乐的平均诱导率分别只有33.3%、40.0% 和42.7%。这表明在MS培养基中添加适量的 2，4-D和6-BA可以显著提高胚性愈伤组织诱导率。

表3 3个黄瓜品种在3种胚性愈伤组织

诱导培养基上的诱导率比较

[注] 1. 3号为詹艳的培养基：MS + 1.0 mg·L-1 2，4-D + 0.5mg·L-1 6-BA + 3.0% 蔗糖 + 0.8% 琼脂。2. 同列不同小写英文字母表示同个品种间差异显著（P≤0.05），下同。

2.3 4 ℃ 低温预处理不同时间对黄瓜花药胚性愈伤组织诱导率的影响

本试验探讨了4 ℃ 低温预处理对黄瓜花药培养的影响（表4）。对供试的3份材料而言，在4 ℃ 低温预处理2 d时，胚状体诱导率显著高于其他处理。这表明对本研究中的3份试材而言，4 ℃ 低温预处理2 d时培养效果最好。同时也说明4 ℃ 低温处理可作为花蕾的一种保存方式。

表4 不同低温预处理时间3个黄瓜品种

胚性愈伤组织诱导率比较

[注] 该试验使用的胚性愈伤组织诱导培养基是MS + 1.0 mg·L-1 2，4-D + 0.5 mg·L-1 6-BA + 3.0% 蔗糖 + 0.8% 琼脂。

2.4 不同胚状体诱导培养基对胚状体诱导的影响

外源激素对黄瓜花药培养诱导成胚亦具有显著影响。结果如表5所示，2号胚状体诱导培养基诱导胚状体效果最佳，HH1-8-57与津绿农家乐平均诱导率分别达到40.0%、35.6% 。而卡罗尔在所有培养基胚状体诱导率均为0。1号胚状体诱导培养基诱导胚状体效果最差，HH1-8-57与津绿农家乐的平均诱导率分别只有17.8%、11.1% 。这说明在黄瓜花药培养中，NAA与6-BA配合使用的比例有可能是成功诱导胚性愈伤组织分化的关键因素。

2.5 不同基因型对黄瓜花药培养的影响

如表6所示，基因型是影响黄瓜花药培养的又一关键因素。不同基因型间胚性愈伤组织诱导率和胚状体诱导率差异显著，津绿农家乐品种胚性愈伤组织诱导率最高，HH1-8-57胚状体诱导率最高，而卡罗尔则得不到胚状体。

表6 不同基因型黄瓜花药培养胚性

愈伤组织和胚状体诱导率比较

2.6 黄瓜再生植株倍性鉴定

黄瓜染色体计数鉴定结果显示，在随机选取的20株再生植株中，HH1-8-57和津绿农家乐分别有10株和3株是单倍体（图2-A)，其余是二倍体（图2-B）。

图2 染色体计数情况

A. 单倍体，2 n=7；B. 二倍体，2 n=14

3 讨 论

花药培养中胚胎发生途径可分为直接胚胎发生和间接胚胎发生。本研究中3份试材均发生了间接胚胎发生，主要经历了胚性愈伤组织诱导、胚状体诱导和胚状体萌发3个阶段。其中又以前2个阶段更为关键。胚性愈伤组织诱导培养基、胚状体诱导培养基、预处理、基因型对诱导胚性愈伤组织和胚状体均具有显著影响。

笔者研究了低温预处理和基因型对黄瓜花药培养的影响，结果显示4 ℃ 低温预处理2 d，胚性愈伤组织诱导效果最佳。温度预处理能够对花药培养产生影响，有可能是因为温度胁迫打乱了小孢子的早期细胞分裂，从而导致小孢子由正常形成花粉粒途径转变为胚性愈伤组织发生途径形成愈伤组织[7-8]。

本研究结果显示詹艳的胚性愈伤组织诱导培养基（MS +1.0 mg·L-1 2，4-D + 0.5 mg·L-1 6-BA + 3.0%蔗糖 + 0.8% 琼脂配合使用）诱导效果最佳。Song的胚状体诱导培养基（MS + 3.0 mg·L-1 6-BA + 0.1mg·L-1 NAA + 3.0% 蔗糖 + 0.8% 琼脂）诱导胚状体效果最佳。这些结果表明在黄瓜花药培养中的胚性愈伤组织诱导培养基添加MS并与2，4-D和6-BA配合，能够显著提高胚性愈伤组织诱导率。2，4-D已被广泛应用于各种作物花药培养的诱导起始阶段，它被认为对诱导小孢子脱分化形成愈伤组织有促进作用[7-9]。不同作物2，4-D的最佳用量不同。NAA与6-BA配合使用的比例有可能是成功诱导胚性愈伤组织分化的关键因素。总的来说，在黄瓜花药培养中，诱导胚性愈伤组织是较易实现的，而诱导胚状体则较难。

多种作物花药培养研究表明，基因型是影响花药培养效果的关键因素，花药顽拗型材料可以通过与花培能力高的亲本杂交，以改善其花培能力[10-12]。本试验的3份材料都可以获得胚性愈伤组织，但是只有2份材料能够获得胚状体和再生植株。表明在黄瓜花药培养过程中，诱导胚性愈伤组织成功分化形成胚有可能是很关键的限速步骤。

4 结 论

通过花药培养可以获得黄瓜单倍体再生植株。本研究筛选的用以黄瓜花药的培养体系为：首先将处于单核靠边期的花蕾置于4 ℃ 下预处理2 d，之后以MS + 1.0 mg·L-1 2，4-D + 0.5 mg·L-1 6-BA + 3.0% 蔗糖 + 0.8% 琼脂为胚性愈伤组织诱导培养基；以MS + 3.0 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA + 3.0% 蔗糖 + 0.8% 琼脂为胚状体诱导培养基；以MS + 0.5 mg·L-1 6-BA + 6.0% 蔗糖 + 1.2% 琼脂为胚状体萌发诱导培养基；以1/2 MS+0.2 mg·L-1 IBA+3% 蔗糖+0.8% 琼脂为生根培养基。

参考文献

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收稿日期： 2011-11-26

基金項目： “863”计划专项（2010AA10A108，2012AA100202）； 江苏省科技支撑计划（BE2009310）；江苏省农业科技自主创新基金[CX（11）1002]

作者简介： Nguyen Thi Thanh Van，女，越南留学生，在读硕士研究生，研究方向为植物组织培养。电子信箱： nguyenthanhvan132@yahoo.com.cn

通讯作者： 陈劲枫，男，教授，博导，研究方向为蔬菜遗传育种与生物技术。电子信箱： jfchen@njau.edu.cn