后沟堡子酒酒曲优势细菌的初步分离与鉴定

赵文婧　石瑛　王瑞祥　单树花

摘要：从山西省晋中市榆次区后沟堡子酒酒曲样品中初步分离纯化出2株细菌XJ1和XJ2，通过形态观察以及生理生化反应分析得出，XJ1白色、中等大小、圆形、菌落呈放射状，XJ2呈乳白色、形状规则、表面呈粉末状、较致密。通过生理生化试验得出，两株细菌的吲哚试验、甲基红试验同呈阳性，两株细菌均能利用葡萄糖和半乳糖，均不能利用蔗糖，XJ1革兰氏染色呈阳性，XJ2革兰氏染色呈阴性。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》可以得出这两株菌株分别是乳酸杆菌属和芽孢杆菌属。

关键词：堡子酒；大曲；细菌；分离

中图分类号：Q93-331文献标识码：A文章编号：0439-8114（2012）20-4604-03

酒类是中国第一大类发酵食品，现在人们视高度白酒为慎用食品，而低度、开胃助消化、营养丰富且具有保健功能的酿造酒已成为人们追求的目标。用曲酿酒是中国酒的特色，在世界酿酒史上独树一帜，是中国的一项伟大发明[1]。日本著名酿酒专家板口谨一郎先生曾经评论，中国发明酒曲酿酒，其影响之大，堪与中国四大发明相比[2]。在现代大致将酒曲分为五大类，麦曲、小曲、红曲、大曲、麸曲，分别用于制作不同的酒。探索酒曲发酵的奥妙，从而揭示其酿酒发酵机理，以利于更有效地指导生产，进行质量控制，改良酒体风格[3]。

纵观世界各国的酿酒史发现，用谷物原料酿酒的技术主要有两大类，一类是以谷物发芽的方式，利用谷物发芽时产生的酶将原料本身糖化成糖分，再用酵母菌将糖分转变成酒精；另一类是用发霉的谷物制成酒曲，用酒曲中所含的酶制剂将谷物原料糖化发酵成酒。传统的酒曲本质之一就是粗酶制剂，但传统的酒曲的最大缺点是酶活较低。在现代由于酶制剂工业的发展，在酒的生产过程中适当加入一部分酶制剂以代替部分传统酶制剂的使用可降低酒的生产成本，但所产生的问题是酒的香味受到一定的影响。

白酒生产微生物是影响产品质量风格的重要因素之一，不同区域的地理环境存在众多不同的微生物菌群。淡雅浓香型白酒应有己酸乙酯为主的复合香气，凸显幽雅飘逸感，口味应努力做到绵柔、醇和、回甜、爽净，具有舒适感；在风格上注重色、香、味的自然谐调感，具有独特淡雅的风格。白酒生产技术是中国劳动人民和科学工作者对世界酿酒工业的特殊贡献。其独特的多种微生物固态发酵酿酒、甑桶蒸馏及其生产工艺形成了白酒的各种风格[4]。白酒的特殊风味来源于参与白酒发酵的微生物种类和数量的多寡，谓之“曲者，酒之骨也。”酿酒原料在微生物的作用下生成各种呈香味物质，所以微生物的种类又是关键因素。由于微生物之间存在着互生、共生、寄生、拮抗的关系，在白酒生产过程中逐渐形成一个靠自然给予、异常复杂并与环境相适应的微生物区系。这种区系的存在在很大程度上决定白酒的风格。

本研究采用的酒曲样品来源于山西省晋中市榆次区后沟堡子酒酒厂。该酒厂以当地盛产的高粱为主料，谷糠为辅料，大麦、豌豆踩制的大曲为糖化发酵剂，利用地缸固体分离发酵和清蒸二次传统工艺进行酿造，酿制出了原有风味的堡子酒。大曲中含有细菌、霉菌、酵母菌等多种微生物，因此发酵过程极为复杂，各种微生物的生理性能不同，其作用也各异。探讨堡子酒酒曲中细菌的生化活性，通过微生物平板分离纯化技术，采用稀释、涂布、恒温培养、生理生化等试验，对酒曲中的细菌进行初步分离鉴定，从而揭示堡子酒发酵过程中的细菌种类，为优化酒质量，改善酒质，提高堡子酒营养价值，开发堡子酒系列新品种提供参考。

对于国内研究酒曲细菌分离和鉴定的试验来说，堡子酒的研究属于首例，对于堡子酒本身来说填补了其空白，为堡子酒品质的提高提供依据；另一方面堡子酒属于清香型白酒，它和汾酒同属一个系列，该项研究提升堡子酒本身价值的同时，也为国内清香型白酒的研究做了一定的补充。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料后沟堡子酒酒曲由山西省晋中市榆次区后沟堡子酒酒厂提供。

1.1.2仪器与设备海尔HRCJ-2D型无菌操作台、海尔HRSP-250H型恒温培养箱和海尔摇床购自上海富众生物科学有限公司，CL-32L型灭菌锅购自日本ALP，MP4002型电子天平购自上海恒平科学仪器有限公司，H5-1型磁力加热搅拌器购自郑州长城仪器有限公司。酒精灯、接种环、研钵、纱布、棉花、绳子、三角玻璃棒、1 000 mL烧杯、中号试管、9 cm培养皿、500 mL锥形瓶、1 mL移液管、玻璃珠、德汉氏小管。

1.1.3试剂牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、葡萄糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、蔗糖、半乳糖、淀粉、甲基红、乙醚、对甲基苯甲醛、浓盐酸、溴甲酚紫、无水乙醇、95%乙醇、碘化钾、碘均为分析纯。

1.1.4固体培养基和液体培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂15～20 g，用去离子水定容到1 000 mL，pH 7.4～7.6；淀粉培养基：蛋白胨10 g、可溶性淀粉2 g、氯化钠

5 g、琼脂15～20 g、牛肉膏5 g，用去离子水定容至

1 000 mL，pH 7.2；糖发酵液体培养基：蛋白胨10 g、氯化钠5 g、葡萄糖10 g、蔗糖10 g、半乳糖10 g、16 g/L溴甲酚紫乙醇溶液1 mL，用去离子水定容到

1 000 mL，pH 7.4；吲哚培养基：蛋白胨10 g、氯化钠

5 g，用去离子水定容到1 000 mL，pH 7.6；甲基红（MR）培养基：蛋白胨5 g、磷酸氢二钾5 g、葡萄糖

5 g，用去离子水定容到1 000 mL，pH 7.2～7.4；蛋白胨水培养基：蛋白胨1 g、氯化钠0.5 g，用去离子水定容到100 mL，pH 7.8；葡萄糖蛋白胨水培养基：葡萄糖0.5 g、蛋白胨0.5 g、磷酸二氢钾0.2 g，用去离子水定容到100 mL，pH 7.2～7.4。

1.2方法

1.2.1细菌分离与鉴定的流程榆次后沟堡子酒酒曲中细菌分离与鉴定的流程如下：酒曲菌悬液→平板分离→菌种纯化→生理生化试验→鉴定→检索→结论。

1.2.2菌悬液的制备称取样品1 g，加入到装有9 mL无菌去离子水的锥形瓶内（内有小玻璃珠），用摇床振荡20 min，菌悬液即制备完成。

1.2.3细菌的分离纯化

1）梯度浓度菌悬液的制备。用无菌吸管从菌悬液中吸取1 mL菌液，加入到装有9 mL无菌去离子水的试管中充分混匀，然后从该试管中吸取1 mL菌液加入到另一支装有9 mL无菌去离子水的试管中，混合均匀，依此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、

10-5、10-6不同稀释梯度的菌悬液。

2）细菌的分离。细菌的分离采用牛肉膏蛋白胨培养基[5]，取不同梯度的菌悬液0.1 mL，分别加入到无菌平板中，用涂布棒涂匀，使样品溶液在培养基上分布均匀。放入37 ℃恒温培养箱中培养大约24 h至长出菌落[5]。

3）细菌的纯化。用接种环按无菌操作法分别从平板培养基上挑取一接种环不同形态的菌落，在新的牛肉膏蛋白胨培养基中进行划线分离，分别放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h后进行观察。重复以上操作至培养基上出现单一菌落为止，将纯化得到的菌种进行编号并分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基，继续于37 ℃恒温培养。

1.2.4细菌的鉴定根据经典微生物分类法[6]对细菌进行分类，主要是依据细菌形态学、生理学和生态学特征对细菌进行初步分类，并对菌种的形态特征（如群体特征和个体特征）和生理生化特征进行鉴定[7]。

1）细菌的群体形态学观察[8，9]。细菌的培养特征是指细菌在培养基上的形态和生长习性，主要观察菌落的形状、颜色、大小、透明度、光泽质地、边缘情况及隆起情况等，并记录结果。

2）细菌个体形态的观察。在高倍镜及油镜下分别对获得的单一菌株的个体形态、大小、革兰氏染色、运动性、鞭毛的有无等进行观察[10]，并记录结果。

3）细菌生理生化反应的观察。主要观察细菌的营养源利用情况，代谢特征，能否产酸、产气以及生长发育条件等，对纯化的菌株进行淀粉水解试验、糖发酵试验、MR试验、吲哚试验[10，11]等检测各项生理生化指标。

2结果与分析

2.1细菌的分离结果

从堡子酒酒曲中分离并纯化出2株细菌，分别命名为XJ1和XJ2，主要用于观察两株细菌菌落的形状、颜色、大小、透明度、光泽质地、边缘情况及隆起情况等。

2.2细菌的鉴定结果

2.2.1细菌菌落形态鉴定结果由表1可知，酒曲中的细菌分别为白色和乳白色两种，XJ1半透明、菌落呈放射状，XJ2表面呈粉末状、较致密。

2.2.2细菌个体形态鉴定结果由表2可知，XJ1为革兰氏阳性菌，XJ2为革兰氏阴性菌；两株细菌的形状均为杆状且都有荚膜；XJ1无芽孢，XJ2有芽孢。

2.2.3细菌生理生化鉴定结果对细菌进行各项生理生化测定，所得结果见表3和表4。XJ1和XJ2的吲哚试验均为阳性，MR试验均为阳性，淀粉水解试验中XJ1为阴性、XJ2为阳性，糖发酵试验中XJ1和XJ2均能利用葡萄糖和半乳糖，均不能利用蔗糖。

3小结与讨论

该研究通过对后沟堡子酒酒曲进行分析处理、稀释培养、分离纯化后，根据菌种鉴定文献[5，12]鉴定得到2株细菌XJ1和XJ2。

生理生化反应当中，两株细菌均能利用葡萄糖和半乳糖作为碳源，但均不能利用蔗糖作为碳源，这说明不同的细菌能通过分解不同的糖类来获取其生长所需的营养物质。两株细菌在分解葡萄糖和半乳糖时均只产酸而不产气。两株细菌在进行吲哚试验时均能产生色氨酸酶，它可以分解蛋白胨中的色氨酸，从而产生吲哚和丙酮酸。XJ1对淀粉无分解能力，而XJ2对淀粉有分解能力。

根据其形态观察和生理生化试验结果，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[13]可初步检索得出2株菌株的所属菌属，XJ1为乳酸杆菌属，XJ2为芽孢杆菌属。

酒中的众多香味成分来源于细菌代谢[14，15]。此次试验初步得出了酒曲中细菌的种类，为优化酒质量，改善酒质，提高堡子酒营养价值，开发堡子酒系列新品种提供了科学根据。堡子酒和山西汾酒同属清香型白酒，国内对汾酒的研究已非常广泛，而堡子酒尚属首例，本研究填补了堡子酒研究的空白，并可以充实和完善山西清香型白酒的系统研究。

对酒曲中存在的细菌进行了研究，涉及其分离纯化和初步鉴定，并确定到属。在以后的研究中将采用分子生物学方法对未知菌进行进一步的菌种鉴定。通过对微生物的16 S rDNA序列分析等，从基因水平对酒曲微生物进行定性和定量研究，直接、微观地探讨微生物种群结构、遗传多样性及其与环境间的相互关系，对酒曲进行更深层次的研究，为酒曲生产工艺的改进提供理论支撑。

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