成骨诱导后的骨髓间充质干细胞对外周血单个核细胞增殖的免疫调节作用

解芳等

[摘要]目的：探索骨髓间充质干细胞（BMSCs）及成骨诱导后的骨髓间充质干细胞（OM-BMSCs）对同种异体的外周血单个核细胞（PBMCs）的免疫调节作用。方法：分离比格犬BMSCs，成骨诱导培养基（osteogenic medium，OM）进行成骨诱导，建立BMSCs、OM-BMSCs与同种异体PBMCs的共培养体系，分三种实验条件，共9组。A组：5×104受体PBMCs 加入5×104供体PBMCs共培养；B组：A组组分加入已铺被1×104/孔BMSCs的96孔板；C组：A组组分加入已铺被1×104/孔OM-BMSCs的96孔板；D组：5×104受体PBMCs加入植物血凝素A（PHA）刺激物；E组、F组：将D组组分按B、C组方式处理；G组：5×104受体PBMCs加入IL-2炎症因子；H组、I组：G组组分按B、C组方式处理。A、D、G组分别为三个实验条件的对照组，单独接种1×104/孔BMSCs、OM-BMSCs作为空白对照组Blank1组、Blank2组。以上各组分别培养120h后，应用CellTiter96 Aqueous检测各组PBMCs的增殖情况。结果：在各实验条件下与相应对照组相比较，BMSCs与OM-BMSCs均能抑制双向混合淋巴细胞反应（MLR）中PBMCs的增殖，均能抑制经PHA刺激后PBMCs的增殖，均能抑制经IL-2刺激后PBMCs的增殖（P<0.01）。结论：BMSCs及成骨分化的BMSCs对刺激细胞、PHA、IL-2刺激的同种异体PBMSs的增殖均表现为抑制效应，成骨分化后的骨髓间充质干细胞对同种异体免疫反应仍具有免疫调节作用。

[关键词]成骨分化；骨髓间充质干细胞；同种异体；免疫调节

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）11-1976-05

近年来，随着组织工程的兴起和发展，应用骨髓间充质干细胞（BMSCs）构建组织工程骨已成为骨组织重建修复的一个新途径。骨髓间充质干细胞是一种具有很强自我更新能力的原始细胞，具有多向分化潜能，可分化为不同类型的细胞，如骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等[1-4]，另外研究发现BMSCs免疫原性低且有免疫调节作用。它能抑制由非特异性丝裂原（PHA等）、炎症细胞因子（IL-2、Anti-CD3 Ab）等诱导的淋巴细胞增殖[5-8]。

自体BMSCs要达到一次治疗量，需要在体外大量培养扩增，其过程可能要花大约一个月的时间。因此，对于一些急性严重的骨缺损，可能错过了最佳的治疗时机，将无法应用于其临床治疗。同种异体BMSCs来源广泛，易于获取，弥补了自体细胞来源缺乏的不足，在临床运用上有着广阔的前景和重要的意义。同时，成骨诱导对于构建组织工程骨至关重要，成骨分化后的BMSCs是否仍能发挥免疫调节作用，在体内各种刺激因子的作用下是否能保持免疫调节功能，这是同种异体骨组织工程体内构建成功与否的重要前提。

本实验旨在探索成骨分化的同种异体BMSCs在三种实验条件下（双向MLR、PHA刺激、IL刺激）是否能发挥免疫调节功能，为进一步同种异体组织工程骨的体内构建提供免疫学理论基础。

1材料和方法

1.1 材料：普通级成年Beagle犬3只[许可证号： SCXK （京） 2007-0005]，体重10～13kg，雌雄不限，经北京实验动物质检站检测，由玛斯公司提供，于中国医学科学院整形外科医院动物中心进行饲养，实验过程中对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定[9]。各试剂及仪器见表1。

1.2 方法

1.2.1 犬骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化：原代骨髓间充质干细胞接种后48h换液，去除未贴壁的细胞，继续培养。约7天后细胞生长达80%融合，胰蛋白酶-EDTA消化，按1.6× 104/cm2密度传代。第1次传代后，一部分细胞加入含10nmol/L地塞米松、10mmol/L β-磷酸甘油钠、50μmol/L L-2-磷酸抗坏血酸的DMEM成骨诱导培养基（Osteogenic Medium）；另一部分细胞作为阴性对照，仍用普通含血清培养基进行培养。以后每3天传代1次，传至第2代细胞，倒置相差显微镜下观察。

1.2.2犬骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化鉴定：茜素红染色：制备经成骨诱导培养21天的细胞爬片，4%多聚甲醛固定2h，加入配制的茜素红染液（茜素红0.1g溶于蒸馏水100ml，调节pH值至7.2），染色5min，洗去染液后以丙酮洗数秒、丙酮/二甲苯洗数秒，树酯封片后倒置相差显微镜下观察。

碱性磷酸酶染色：制备经成骨诱导培养14天的细胞爬片，甲醛固定同上，BM-Purple试剂盒染色，染色后固定、封片、镜下观察同上。

1.2.3 第三方BMSCs、OM-BMSCs灭活备用：取第2代BMSCs、OM-BMSCs细胞悬液0.9ml，加入100μg/ml的丝裂霉素C 0.1ml，使其终浓度为10μg/ml，放置于37℃，CO2细胞培养箱灭活2h。之后分别用普通培养基、成骨培养基洗涤3次以去除残余的丝裂霉素C，重悬后细胞计数。按照实验分组，取1×104/孔接种于96孔板相应位置，隔天待BMSCs完全贴壁后将原有培养基吸出，进行后续实验。另外分别单独接种1×104/孔BMSCs、OM-BMSCs作为空白对照组（Blank1组、Blank2组）。

1.2.4 犬外周血单个核细胞（PBMCs）分离抽取2只互为同种异体比格犬外周血5ml，缓慢加入到含有3.5ml Ficoll Plus淋巴细胞分离液的15ml离心管中，离心2000rpm，20min。吸取中间白色云雾状的有核细胞层，即分离得到PBMCs。用淋巴细胞培养基（RPMI1640培养基，含10%FBS、1%青链霉素、50μM 2-ME）重悬后离心1000rpm，5min，洗涤2次后细胞计数，分别作为供体细胞和受体细胞。

1.2.5 第三方BMSCs、成骨诱导的BMSCs（OM-BMSCs）对于双向混合淋巴细胞反应（MLR）中PBMCs增殖的影响：96孔培养板共分三组，每组7个复孔，反应体系总量为200μl，不足者以淋巴细胞培养基补充。A组：将供体和受体犬PBMCs接种于96孔板中，5×104/孔，作为对照组；B组：A组各组分加入已铺被1×104/孔BMSCs的96孔板；C组：A组各组分加入已铺被1×104/孔OM-BMSCs的96孔板。96孔板放置于37℃，5%CO2培养箱内培养120h后，加入CellTiter96 Aqueous One Solution Assay 20μl，再放回细胞培养箱内孵育4h，用酶标仪在490nm波长测定PBMCs的OD值。OD值（B组-Blank1）代表B组PBMCs的增殖情况；OD值（C组-Blank2）代表C组PBMCs的增殖情况。

1.2.6第三方BMSCs、OM-BMSCs对于经PHA刺激后的PBMCs增殖的影响：96孔培养板共分三组，每组7个复孔，反应体系总量为200μl，不足者以淋巴细胞培养基补充。D组：将受体犬PBMCs接种于96孔板中，5×104/孔，加入植物血凝素A（PHA），终浓度为1μg/ml，作为对照组；E组：D组各组分加入已铺被1×104/孔BMSCs的96孔板； F组：D组各组分加入已铺被1×104/孔OM-BMSCs的96孔板。96孔板放置于37℃，5%CO2培养箱内培养120h后，加入CellTiter96 Aqueous One Solution Assay 20μl，再放回细胞培养箱内孵育4h，用酶标仪在490nm波长测定PBMCs的OD值。OD值（E组-Blank1）代表E组PBMCs的增殖情况；OD值（F组-Blank2）代表F组PBMCs的增殖情况。

1.2.7第三方BMSCs、OM-BMSCs对于经IL-2刺激后的PBMCs增殖的影响：96孔培养板共分三组，每组7个复孔，反应体系总量为200μl，不足者以淋巴细胞培养基补充。G组：将受体犬PBMCs接种于96孔板中，5×104/孔，加入IL-2、OKT3（anti-CD3 antibody），终浓度为100U/ml，作为对照组。H组：G组各组分加入已铺被1×104/孔BMSCs的96孔板；I组：G组各组分加入已铺被1×104/孔OM-BMSCs的96孔板。96孔板放置于37℃，5%CO2培养箱内培养120h后，加入CellTiter96 Aqueous One Solution Assay 20μl，再放回细胞培养箱内孵育4h，用酶标仪在490nm波长测定PBMCs的OD值。OD值（H组-Blank1）代表H组PBMCs的增殖情况；OD值（I组-Blank2）代表I组PBMCs的增殖情况。

1.2.8 统计学分析：应用SPSS13.0软件进行统计学处理，数据以x±s表示，组间均数比较行一维方差分析，P<0.05为差异有显著性意义。

2结果

2.1 骨髓间充质干细胞体外成骨诱导分化及鉴定：应用密度梯度离心法分离得到原代BMSCs，接种培养48h 后逐渐形成大而清晰的细胞集落形成单位，贴壁细胞呈长梭形，形态类似于成纤维细胞（图1），培养7天后，细胞融合达80%以上，胰酶消化传代后细胞迅速进入快速增殖期，经成骨诱导培养基培养后，逐渐由长梭形渐变为短粗形或三角形（图2）。成骨诱导后14天，碱性磷酸酶染色呈阳性，细胞胞浆呈蓝、绿色