重组腺相关病毒介导的IL—32基因抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的机制研究

张培华　李小川　李瑾　邹雅琴　梁杰

[摘要]目的：探讨重组腺相关病毒介导的IL-32基因抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞（Keloid fibroblasts，KFs）增殖的机制。方法：用重组腺相关病毒介导的IL-32（rAAV2 IL-32）及腺相关病毒空载体感染人KFs，通过荧光显微镜观察rAAV2 IL-32的感染效率，RT-PCR法检测IL-32的转录水平；用MTT法检测KFs增殖的情况；用蛋白质印迹方法检测Bcl-2、BAX、TGF-β1的表达。结果：rAAV2 IL-32及腺相关病毒空载体感染KFs 48h后，RT-PCR检测显示rAAV2 IL-32组出现高表达电泳条带，而腺相关病毒空载体组则未出现电泳条带；MTT法检测显示rAAV2 IL-32组明显抑制了KFs的增殖；蛋白质印迹结果显示rAAV2 IL-32组KFs中Bcl-2、TGF-β1表达降低，BAX表达增高。结论：rAAV2 IL-32 可能是通过减少KFs中Bcl-2和TGF-β1的表达以及增加BAX的表达来抑制瘢痕疙瘩的增殖。

[关键词]白细胞介素32；瘢痕疙瘩；Bcl-2；TGF-β1；BAX

[中图分类号]R619+.6[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）11-1987-04

人白介素32 （interleukin-32， IL-32）最早于1992年由Dahl等[1]提出，2005年Kim SH等[2]研究发现其有多种炎症反应细胞因子的特性。目前研究证实IL-32不仅可诱导炎性细胞因子产生，而且在调节细胞增殖与凋亡中发挥重要作用[3]，临床上已经用于防治肿瘤和结缔组织疾病的研究 [4]。瘢痕疙瘩具有肿瘤样生长的生物学特性，是一种自身免疫性、炎症性疾病[5]。有关重组腺相关病毒介导的IL-32基因（rAAV2 IL-32）抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞（Keloid Fibroblasts，KFs）增殖的机制研究尚未见文献报道，由此，笔者通过构建IL-32基因重组腺相关病毒表达载体并转染KFs，研究IL-32基因对KFs增殖的影响及机制探讨，从另一角度认识瘢痕疙瘩的发病机制，可能从分子水平上为瘢痕防治提供新的思路。

1材料和方法

1.1 材料：rAAV2 IL-32及重组腺相关病毒空载体（广州莱德尔生物科技公司设计提供），KFs（广东医学院整形外科研究所），小牛血清和DMEM培养基（Gibco公司），MTT（Sigma公司），IL-32引物：IL32-F TCCCGAAGGTCCTCTCTGAT，IL32-R CATAATAAGCCGCCACTGTCT、BCL2引物：BCL2-F TCATGTGTG TGGAGAGCGTC，BCL2-R AGCCTCCGTTATCCTGGATC、BAX引物：BAX-F GATGCGTCCACCAAGAAGCT，BAX-R CGGCCCCAGTTGAAGTT G、TGF-β1引物：TGF-β1-FCACGTGGAGCTGTACCAGAA，TGF-β1-R GAACCCGTTGATGTCCACTT、18srRNA引物：18srRN A-F CCTGG ATACCGCAGCTAGGA、18srRNA-R GCGGCGCAATACGA ATGCCCC（上海生工生物科技有限公司合成）。人IL-32、Bcl-2、BAX、TGF-β1抗体（北京博尔迈生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 重组腺相关病毒载体rAAV2-IL-32的病毒滴度测定：应用CMV探针（地高辛标记）点杂交方法检测病毒液中rAAV2-IL-32的物理滴度（以病毒基因组数/ml，vg/ml表示）。准确定量质粒SV40，用稀释缓冲液（梯度稀释后）点样尼龙膜上；待测病毒液rAAV2-IL-32样品用DNase I和RNase稀释，终浓度均为1μg/ml，于37℃消化1h，提取rAAV2 DNA， 100℃水浴5min变性，置于冰浴中。按试剂盒说明以一定比例稀释缓冲液后点膜。按Boehringer Mannheim公司试剂盒说明书，再进行预杂交、杂交、洗膜、显色。通过计算IL-32的拷贝数、再乘以与其杂交信号强度一致的病毒液样品的稀释倍数而得出rAAV2-IL-32的物理滴度，滴度计算公式：滴度（v.g./ml）= 杂交信号对应的拷贝数×2×稀释倍数。

1.2.2 细胞培养：KFs的培养：含10%小牛血清的DMEM培养基，置于CO2培养箱内（37℃，5% CO2）培养。当细胞铺满瓶底时进行消化、传代。实验用3～4代细胞。

1.2.3 荧光显微镜观察rAAV2-IL-32感染效果：按照常规方法扩增腺相关病毒，分别以感染复数（MOI）103，104，105的比例感染KFs，通过荧光显微镜观察感染48h后EGFP的表达，并以此选择最佳感染浓度。

1.2.4 RT-PCR方法检测IL-32转录表达：rAAV2-IL-32感染KFs48h后，收获1×105细胞，离心沉淀，抽提总RNA，按照试剂盒说明书进行逆转录，用IL-32的引物做PCR检测，PCR的反应条件为94℃ 4min，94℃ 50s，55℃ 50s，72℃ 1min，35个循环，72℃ 10min。

1.2.5 MTT法检测rAAV2-IL-32对KFs增殖的影响：以10%小牛血清DMEM配成浓度为1×105/ml的细胞悬液，加入96孔培养板；每孔100μl，37℃、5% CO2孵育过夜；分别以感染复数（MOI）103，104，105的比例加入IL-32及腺相关病毒空载体作为对照（每组设3个复孔），37℃、5% CO2孵育72h后，每孔加MTT（5mg/ml）10μl；继续孵育4h后加入溶解剂10%SDS，1%HCL（1mol/L），每孔100μl，37℃孵育，6h后在多功能酶标仪上测吸光度（570nm）值，并计算相对增殖率。

1.2.6 RT-PCR方法检测rAAV2-IL-32感染KFs后的Bcl-2、BAX、TGF-β1的表达：rAAV2-IL-32感染KFs48h后，收获1×105细胞，离心沉淀，提取总RNA，按照试剂盒说明书作逆转录。用IL-32的引物做PCR检测，PCR的反应条件为：94℃ 4min，94℃ 50s，55℃ 50s，72℃ 1min，35个循环，72℃ 10min。

1.2.7 蛋白质印迹检测rAAV2-IL-32感染KFs后的Bcl-2、BAX、TGF-β1的表达：rAAV2-IL-32感染KFs48h后，收集细胞，PBS洗涤2次，加入裂解缓冲液，冰上放置30min。然后在4℃、15 000×g离心15min，收集样品并与上样缓冲液一起煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳；再将凝胶蛋白转印到硝酸纤维膜上，经5%脱脂奶粉封闭1h，加入一抗室温孵育2h，TBST缓冲液洗3次，再加入辣根过氧化酶标记的二抗孵育1h，ECL发光液作用1min后以化学发光凝胶成像系统扫描记录实验结果，并进行定量分析。

1.2.8 统计分析：实验数据采用SPSS15.0统计学软件分析，计量资料结果用均数±标准差（x±s）表示；兩组间差异比较用t检验，三组间差异比较用方差分析和q检验。P>0.05差异无统计学意义，P<0.05差异有统计学意义。

2结果

2.1 重组腺相关病毒载体rAAV2-IL-32的病毒滴度测定（表1），病毒滴度为 5.2×1011 v.g./ml。

2.2IL-32在KFs中的表达

2.2.1rAAV2-IL-32感染KFs后的荧光表达：rAAV2-IL-32感染KFs48h后，荧光显微镜观察细胞，rAAV2-IL-32在感染复数（MOI）105时感染效率达50%以上（图2、3）。说明重组腺相关病毒转染成功，感染效率达到实验要求。

2.2.2RT-PCR结果：rAAV2-IL-32感染KFs经RT-PCR验证在570bp处出现高表达电泳条带，而腺相关病毒空载体组则未出现电泳条带，表明rAAV2-IL-32在KFs中过表达（图4）。

2.3 rAAV2-IL-32对KFs增殖能力的影响：腺相关病毒空载体和rAAV2-IL-32按照不同的感染复数浓度感染KFs，72h后，用MTT检测方法分析KFs相对增殖率（图5）。结果显示：rAAV2-IL-32组比对照组细胞增殖率差异有显著性（P<0.05），表明体外转染IL-32基因后可抑制KFs生长，且有浓度依赖性。

2.4 RT-PCR方法检测rAAV2-IL-32感染KFs后Bcl-2、BAX、TGF-β1的表达（表2）。

2.4.1Bcl-2、TGF-β1的表达结果：rAAV2-IL-32感染KFs 48h后，结果显示： Bcl-2、TGF-β1在KF组的表达水平明显高于正常皮肤组（P<0.05）；Bcl-2、TGF-β1在KF-IL-32组的表达水平明显低于KF组和KF-EGFP组（P<0.05），说明体外感染rAAV2-IL-32 能显著降低Bcl-2、TGF-β1在KFs中的表达水平。

2.4.2BAX的表达结果：rAAV2-IL-32感染KFs 48h后，结果显示：BAX在KF组的表达水平明显低于正常皮肤组（P<0.05）；BAX在KF-IL-32组的表达水平明显高于KF组和KF-EGFP组（P<0.05），说明体外感染rAAV2-IL-32能显著升高BAX在KFs中的表达水平。

2.5 蛋白质印迹检测rAAV2-IL-32感染KFs后Bcl-2、BAX、TGF-β1的表达：rAAV2-IL-32感染KFs 48h后，蛋白质印迹法检测显示Bcl-2、TGF-β1的表达水平降低，BAX的表达升高（图6），表明体外感染rAAV2-IL-32可上调BAX蛋白的表达，同时下调Bcl-2、TGF-β1蛋白的表达。

3讨论

近来许多研究表明，瘢痕疙瘩的形成可能与基因的结构、功能或表达异常有关，但其调控机制尚不明确。瘢痕疙瘩在临床表现及组织病理学改变等方面与良性肿瘤有某些相似之处，研究发现肿瘤相关基因及细胞因子在瘢痕疙瘩与正常皮肤中存在表达差异[6]，它们在瘢痕疙瘩的发生发展中起着重要作用。人IL-32基因定位于染色体16p13.3上，含有8个小外显子，跨长约5kb。人IL-32 mRNA长为1.2kb，在免疫组织中表达增强[7]。目前发现，IL-32一共有6种剪接变异体[11]：IL-32α、IL-32β、IL-32γ、IL-32δ、IL-32ε和IL-32ζ蛋白。IL-32的主要生物学功能：①诱导产生炎症细胞因子[4]；②是重要的调节细胞增殖与凋亡的基因：在T细胞中，IL-32的大量表达可诱导细胞凋亡[8]；③在自身免疫性、炎症性疾病里起重要作用[9]：IL-32可诱导多种细胞因子的产生，同时与多种炎症性疾病密切相关；是一种前炎症反应细胞因子，与疾病的严重性程度相关，在适应性免疫应答和固有性免疫应答中发挥作用。

在瘢痕疙瘩组织中及体外培养的KFs中均发现了细胞增殖调控及细胞凋亡方面的异常。研究显示凋亡相关基因的表达异常与瘢痕疙瘩的形成相关[10]。本课题组前期研究结果提示人IL-24基因在瘢痕疙瘩组织中的表达低下[11]。本研究发现人IL-32基因调控细胞凋亡机制与IL-24基因（肿瘤抑制基因）具有一致性，提示IL-32基因可作为病理性瘢痕基因治疗的有效候选靶基因之一。

原癌基因Bcl-2有促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用，TGF-β1可促进瘢痕成纤维细胞的增殖与分化，从而参与病理性瘢痕的形成。与其相对应的细胞凋亡相关基因BAX则可促进瘢痕成纤维细胞凋亡。本实验成功将人IL-32基因腺相关病毒载体导入到人KFs中，通过RT-PCR及蛋白质印迹检测显示：Bcl-2、TGF-β1在KF组的表达水平高于正常皮肤组；BAX的表达水平低于正常皮肤组。而Bcl-2、TGF-β1在KF-IL-32组的表达水平明显低于KF组和KF- EGFP组；BAX在KF-IL-32组的表达水平高于KF组和KF- EGFP组。提示IL-32在mRNA和蛋白水平通过抑制Bcl-2、TGF-β1的表达或者同时提高BAX表达从而抑制瘢痕的增生。这有可能是IL-32基因抑制瘢痕疙瘩增生的机制之一。

本实验仅研究了IL-32基因在体外实验中对KFs部分细胞因子间的相互作用。而IL-32基因与其他细胞因子间的作用以及通过何种信号转导途径影响瘢痕凋亡，还有待进一步研究。

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[收稿日期]2012-09-21 [修回日期]2011-11-03

编辑/张惠娟