适用于SSR—PCR试验的水稻基因组DNA提取方法的比较

王婧　杨洁等

摘要：为了寻找操作简便、耗时短、成本低的适用于简单重复序列－聚合酶链式反应（ＳＳＲ－ＰＣＲ）试验的水稻基因组ＤＮＡ提取方法，试验以３种类型的水稻样品（叶片、米粒、米粉）为材料，比较了十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）法、试剂盒法、蔗糖法、碱法４种基因组ＤＮＡ提取方法对水稻基因组ＤＮＡ提取质量的影响。结果表明，ＣＴＡＢ法提取的叶片、米粒和米粉的基因组ＤＮＡ含量最高，其次为试剂盒法提取的叶片、米粉和碱法提取的米粉的基因组ＤＮＡ含量。通过４种方法得到的水稻基因组ＤＮＡ纯度均不高，但不影响后续的ＳＳＲ－ＰＣＲ试验。ＳＳＲ－ＰＣＲ结果表明，ＣＴＡＢ法、试剂盒法和碱法提取的３种样品类型的水稻基因组ＤＮＡ的扩增均表现出了良好的重复性。其中试剂盒法的提取成本最高，ＣＴＡＢ法耗时最长。整体而言，碱法是最适合水稻ＳＳＲ－ＰＣＲ试验的基因组ＤＮＡ提取方法，且以米粉为提取材料时效果最佳。

关键词：水稻；基因组ＤＮＡ；提取方法

中图分类号：Ｓ５１１；Ｑ５２３；Ｑ７８１ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）24－5794-04

水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）是世界上三大粮食作物之一，中国的稻田面积占世界稻田面积的２２％［１］。在水稻和其他大多数作物中，以聚合酶链式反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）技术为基础的分子标记分析如简单重复序列（Ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，ＳＳＲ）标记由于其具有多态性好、可靠性高、技术简单、价格便宜和ＤＮＡ模板使用量低等优点，在分子生物学技术中得到了广泛的应用。ＤＮＡ提取是ＳＳＲ－ＰＣＲ分析的前提。在这一研究中，往往要对几十个乃至几百个样品提取的基因组ＤＮＡ进行ＳＳＲ分析。这就需要进行大量的ＤＮＡ提取工作，而常规ＤＮＡ提取过程比较复杂，是分子标记分析效率提高及成本降低的关键性因素［２］。事实上，针对ＳＳＲ的ＰＣＲ技术对ＤＮＡ质量的要求不是很高，运用一些简单快速的方法获得的基因组ＤＮＡ就可以满足其需要。因而发展简便快速提取基因组ＤＮＡ的方法就显得尤为重要。目前，国内外已建立了多种基因组ＤＮＡ的提取方法，这些方法因所研究的对象和目的不同而有一定的差异，主要是十六烷基三甲基溴化铵（Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，ＣＴＡＢ）法、碱法和蔗糖法等，并且多数方法是基于叶片的基因组ＤＮＡ提取为前提［３－７］，所以基于种子基因组ＤＮＡ的提取方法也日益受到研究者的重视［８］，但基于米粉的基因组ＤＮＡ提取方法却鲜有报道。试验比较了以３种类型的水稻样品（叶片、米粒、米粉）为材料的４种基因组ＤＮＡ提取方法（ＣＴＡＢ法、试剂盒法、蔗糖法、碱法）提取的基因组ＤＮＡ浓度和质量，并分析了ＳＳＲ－ＰＣＲ检测结果，试图找出操作简便、耗时短、成本低的水稻基因组ＤＮＡ提取方法。

１ 材料与方法

１．１ 材料

水稻品系为Ｋ４７８、Ｋ４８０、Ｋ４８２，由湖北省农业科学院粮食作物研究所提供；将试验里进行基因组ＤＮＡ提取的样品类型分为３类：Ａ，正常条件下发芽７ｄ的水稻幼嫩叶片样品；Ｂ，单株种子样品；Ｃ，１粒去壳的水稻种子经植物球磨仪研磨后所得到的米粉样品。

１．２ ＤＮＡ提取方法

１．２．４ 方法４ 参考植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒的操作手册里提取与纯化基因组ＤＮＡ的有关方法，将3种样品进行相关处理，得到可以用做ＰＣＲ模板的材料溶液。

２ 结果与分析

２．１ 核酸蛋白检测仪检测水稻基因组ＤＮＡ纯度与含量

２．２ ＳＳＲ－ＰＣＲ扩增

以４种方法提取不同材料类型的３个水稻品系ＤＮＡ为模板，选取２对ＳＳＲ引物ＲＭ３３６和ＲＭ２９７扩增水稻的ＤＮＡ样品，结果见图１、图２。从图１、图２可见，４种方法提取的水稻基因组ＤＮＡ大多数都扩增出了电泳条带，虽然不同样品的质量及浓度明显不同，而且所有样品都存在不同程度的污染现象，但这些因素显然没有对ＰＣＲ扩增造成明显的影响。引物ＲＭ３３６和ＲＭ２９７扩增的带型在某些样品间存在一定差异，能够反映出这些样品的基因型不同，说明４种方法提取的水稻基因组ＤＮＡ完全能满足ＳＳＲ-PCR分析的需要，可用于种子真实性和纯度的快速鉴定。其中ＣＴＡＢ法、碱法和试剂盒法提取不同材料类型的水稻基因组ＤＮＡ扩增结果都得到了较好地重复，说明这３种方法提取的水稻基因组ＤＮＡ用于ＳＳＲ-PCR试验结果稳定；而蔗糖法的扩增成功率则低于其他３种方法，说明蔗糖法提取的水稻基因组ＤＮＡ含量偏低。

２．３ ４种ＤＮＡ提取方法的成本分析

３ 小结与讨论

ＳＳＲ分子标记具有数量丰富、多态性高、结果稳定可靠等优点，因此在作物品种纯度鉴定［１３］、遗传多样性分析［１４］等方面得到了日益广泛的应用。虽然ＳＳＲ分子标记技术对模板ＤＮＡ纯度和含量的要求不高，但是高质量的ＤＮＡ是检测结果稳定可靠并有较高重复性的有力保障。目前，ＤＮＡ提取方法种类繁多，有传统的ＳＤＳ法、ＣＴＡＢ法，简化后的碱法和蔗糖法等，但在效率上仍然有改进的空间。尤其是对大批量的水稻样品进行ＳＳＲ分析时，需要寻找一种操作简便、耗时短、成本低且又能保证扩增质量的最适水稻基因组ＤＮＡ提取方法。因此有必要在现有基础上进一步简化和比较各种提取方法。

通过比较ＣＴＡＢ法、试剂盒法、蔗糖法、碱法提取的水稻基因组ＤＮＡ，发现以ＣＴＡＢ法提取的水稻叶片、米粒和米粉的水稻基因组ＤＮＡ含量最高，其次是试剂盒法提取的叶片、米粉和碱法提取的米粉的水稻基因组ＤＮＡ含量较高，反映出最大限度地使水稻样品均匀分散而得到的米粉样品成为了提取ＤＮＡ最佳的材料形态。同时发现４种方法提取的ＤＮＡ纯度均不高，其中以试剂盒法和ＣＴＡＢ法较好，原因可能是碱法和蔗糖法在提取ＤＮＡ时只保留了裂解组织、ＤＮＡ沉淀和溶解等主要步骤，而摒弃了蛋白质和有机物清除等中间步骤，导致提取的ＤＮＡ中存在蛋白质、糖类、有机物小分子等物质的污染，进而降低了纯度。ＳＳＲ－ＰＣＲ结果显示，ＣＴＡＢ法、试剂盒法和碱法提取不同类型材料的ＤＮＡ扩增结果都得到了很好地重复，说明这３种方法提取的ＤＮＡ用于ＳＳＲ试验结果稳定。但其中试剂盒法的提取成本很高，提取每１００个样品的成本高达５７２．０８元，远远高于其余３种方法；而ＣＴＡＢ法耗时很长，提取每个样品的时间是耗时最短的碱法的７倍左右。

综上可知，碱法提取水稻基因组ＤＮＡ是４种方法中性价比最高的方法，尤其以米粉作为材料提取ＤＮＡ效果最佳。该方法制备模板操作时间短、效率高、重复性好、成本低，并且制备过程无需使用有机溶剂，可避免有机试剂对人体的毒害作用。因此，用碱法快速地从大量样本中提取水稻基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，可广泛地应用于水稻基因组ＤＮＡ分子标记相关的科学试验及生产实践中。

参考文献：

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