水稻TWH基因RNAi载体的构建及遗传转化

李进波　查中萍　万丙良　戚华雄

摘要：根据ＲＮＡｉ表达载体的设计原则，以ＴＷＨ基因为靶基因，将长度２５３ｂｐ目的片段通过正反两个方向插入表达载体ｐＲ１３０１中，构建ＲＮＡｉ表达载体ｐＲ１３０１－ＴＷＨ。通过根癌农杆菌ＥＨＡ１０５介导法将其导入水稻品种武育粳３号，获得３４株阳性转基因植株，为进一步深入研究ＴＷＨ基因功能奠定了基础。

关键词：水稻（OryzasativaL.）；ＴＷＨ基因；ＲＮＡｉ（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）；载体构建；遗传转化

中图分类号：Ｓ５１１；Ｑ７８１ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）24－5791-03

ＲＮＡ干涉（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）是指内源性或外源性双链ＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ，ｄｓＲＮＡ）介导的同源ｍＲＮＡ发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默从而产生相应的功能表型的缺失现象，属于转录后的基因沉默现象。ＲＮＡｉ是在研究秀丽新小杆线虫中被首次发现［１］，利用这一技术可以有效、特异性降解靶标基因ｍＲＮＡ，阻止靶标基因的表达，从而研究目标基因的功能。

目前，水稻中已有许多利用ＲＮＡｉ技术进行基因功能分析或验证的报道［２－４］。从水稻育种后代材料中发现一个水稻颖壳扭曲突变体，该突变体主要表现为颖壳扭曲变形，子粒充实不饱满［５］。进一步的研究结果表明，该突变体颖壳扭曲性状受一对隐性基因控制，其对应的ＴＷＨ基因被精细定位在第二染色体的ＳＳＲ标记ＲＭＬ２５和ＲＭＬ３５之间，两个ＳＳＲ标记间的物理距离为１１．９ｋｂ，并确定了其候选基因。该研究通过构建水稻ＴＷＨ基因的ＲＮＡｉ表达载体，利用根癌农杆菌ＥＨＡ１０５介导法将其导入水稻品种武育粳３号中，获得了转基因水稻植株，为ＴＷＨ基因的功能研究奠定了基础。

１ 材料与方法

１．１ 试剂

１．２ 载体及菌株

１．３ 植物材料和遗传转化方法

供试水稻材料为武育粳３号成熟种子诱导初生愈伤组织，作为与农杆菌共培养转化的受体材料。水稻的组织培养、农杆菌介导转化水稻以及抗性愈伤组织的筛选与植株再生等参照刘巧泉等［６］建立的高效转化方法进行。

１．４ ＰＣＲ引物设计及目的片段扩增

１．５ 目的片段的克隆

将目的片段切下，通过胶回收试剂盒回收ＰＣＲ产物并纯化后连接到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，涂布在含１００ｍｇ／Ｌ氨苄青霉素的Ｘ－Ｇａｌ／ＩＰＴＧ的ＬＢ固体培养基上，３７℃培养过夜，挑取白色单菌落于含１００ｍｇ／Ｌ氨苄青霉素的ＬＢ液体培养基中培养过夜，通过菌落ＰＣＲ筛选阳性克隆，获得重组载体ｐＭＤ１８－Ｔ－ＴＷＨ，将阳性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

１．６ ＲＮＡｉ表达载体的构建

１．７ 转基因植株的ＰＣＲ检测

２ 结果与分析

２．１ ＲＮＡｉ表达载体构建

２．２ 水稻遗传转化及转基因植株的获得

以武育粳３号成熟胚诱导的愈伤组织作为转化受体，经根癌农杆菌ＥＨＡ１０５介导的遗传转化方法将表达载体ｐＲ１３０１－ＴＷＨ导入水稻中。经潮霉素抗性筛选，选择生长旺盛的抗性愈伤组织进行分化再生培养，最终获得４０株T0代转基因植株。以转基因植株叶片总ＤＮＡ为模板，用潮霉素基因特异引物Ｐ７与Ｐ８进行ＰＣＲ检测（图５），共有３４株检测到５１７ｂｐ左右的目标片段，ＰＣＲ阳性率为８５％。

３ 小结与讨论

１）虽然ＲＮＡ干涉在作用机制等方面还不十分清楚，但作为一种新的技术方法，已经在各个不同的生物研究中被广泛应用。应用ＲＮＡ干涉技术迅速地抑制目的基因的表达，能尽快了解到目的基因的功能。该研究将构建的表达载体ｐＲ１３０１－ＴＷＨ导入水稻愈伤组织中，获得了阳性转基因植株，下一步计划将转基因苗移栽到海南试验基地，抽穗后进行表型鉴定和表达分析，研究ＴＷＨ基因的功能。

２）载体设计是载体构建的关键。由于ＲＮＡｉ机制只对成熟的ｍＲＮＡ产生作用，因此用于设计ＲＮＡ干涉载体的靶序列应处于基因的一个外显子内。Ｗｅｓｌｅｙ等［７］的研究表明ＲＮＡｉ片段的长度在９８～８５３ｎｔ之间都是可行的，不会对沉默效率产生明显影响；同时将间隔区内含子插入反向互补重复区可以增强其稳定性。因此，在本研究中我们选择ＴＷＨ基因一个外显子部分的２５３ｂｐ为靶序列构建ＲＮＡｉ载体，并在两个反向重复序列间加入一个Ｗａｘｙ基因的内含子作为间隔区，目的是为了提高转基因后代的沉默效率，有效抑制目的基因的表达。

参考文献：

［１］ＦＩＲＥＡ，ＸＵＳＱ，ＭＯＮＴＧＯＭＥＲＹＭＫ，ｅｔａｌ．Ｐｏｔｅｎｔａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅｔｉｃｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｂｙｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡｉｎＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９１（６６６９）：８０６－８１１．

［２］ＣＨＥＮＪ，ＴＡＮＧＷＨ，ＨＯＮＧＭＭ，ｅｔａｌ．ＯｓＢＰ－７３，ａｒｉｃｅｇｅｎｅ，ｅｎｃｏｄｅｓａｎｏｖｅｌＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈａＳＡＰ－ｌｉｋｅｄｏｍａｉｎａｎｄｉｔｓｇｅｎｅｔｉｃｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｂｙｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡｉｎｈｉｂｉｔｓｒｉｃｅｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００３，５２（３）：５７９－５９０．

［３］ＰＲＡＳＡＤＫ，ＶＩＪＡＹＲＡＧＨＡＶＡＮＵ．Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｏｆａｒｉｃｅＰＩ／ＧＬＯｐａｒａｌｏｇ，ＯｓＭＡＤＳ２，ｕｎｃｏｖｅｒｓｉｔｓｓｅｃｏｎｄ－ｗｈｏｒｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｆｌｏｒａｌｏｒｇａｎｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００３，１６５（４）：２３０１－２３０５．

［４］ＸＩＡＯＨ，ＷＡＮＧＹ，ＬＩＵＤ，ｅｔａｌ．ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｒｉｃｅＡＰ３ｈｏｍｏｌｏｇｕｅＯｓＭＡＤＳ１６ｂｙＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２００３，５２（５）：９５７－９６６．

［５］ＬＩＪＢ，ＸＩＡＭＹ，ＷＡＮＢＬ，ｅｔａｌ．ＧｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｍａｐｐｉｎｇｏｆＴＷＨｇｅｎｅｉｎｒｉｃｅｔｗｉｓｔｅｄｈｕｌｌｍｕｔａｎｔ［Ｊ］．ＲｉｃｅＳｃｉｅｎｃｅ，２００９，１６（１）：７９－８２．

［６］刘巧泉，张景六．根癌农杆菌介导的水稻高效转化系统的建立［Ｊ］．植物生理学报，１９９８，２４（３）：２５９－２７１．

［７］ＷＥＳＬＥＹＳＶ，ＨＥＬＬＩＷＥＬＬＣＡ，ＳＭＩＴＨＮＡ，ｅｔａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｄｅｓｉｇｎｆｏｒｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｅｆｆｅｃｔｉｖｅａｎｄｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，２００１，２７（６）：５８１－５９０．