二氧化氯对气单胞菌的抑菌和杀菌效果研究

2012-04-29谭凤霞吴全超

湖北农业科学 2012年3期

谭凤霞吴全超

摘要：以嗜水气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）标准菌株ＡＴＣＣ７９６６和分离自养殖水环境及患病鲫鱼的气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）为试验菌株，通过肉汤二倍稀释法研究二氧化氯的抑菌及杀菌效果。结果表明，二氧化氯在低浓度时能抑制气单胞菌的生长增殖，高浓度时能杀灭细菌，其对ＡＴＣＣ７９６６、Ｔ１、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６菌株的最小抑菌浓度（ＭＩＣ）为１２ｍｇ／Ｌ，对Ｔ２菌株的最小抑菌浓度为２４ｍｇ／Ｌ；二氧化氯对ＡＴＣＣ７９６６、Ｔ１、Ｔ３、Ｔ４菌株的最小杀菌浓度（ＭＢＣ）为９６ｍｇ／Ｌ，对Ｔ２、Ｔ５、Ｔ６菌株的最小杀菌浓度为３８４ｍｇ／Ｌ。研究结果能为二氧化氯在水产养殖上的合理使用提供一定的依据。

关键词：二氧化氯；气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）；最小抑菌浓度；最小杀菌浓度

中图分类号：Ｓ859.79+9.1文献标识码：Ａ文章编号：０４３９－８１１４（２０１２）０３－０５67－０4

Ｒｅｓｅａｒｃｈｏｎ Bａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃａｎｄ BａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌＥｆｆect ｏｆＣｈｌｏｒｉｎｅＤｉｏｘｉｄｅｏｎＡｅｒｏｍｏｎａｓ

ＴＡＮＦｅｎｇ－ｘｉａ，ＷＵＱｕａｎ－ｃｈａｏ

（ＳｃｈｏｏｌｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＹａｎｇｔｚｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｇｚｈｏｕ４３４０２５，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｅｒｏｍｏｎａｓｂａｃｔｅｒｉａｓｔｒａｉｎｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｂａｃｔｅｒｉａＡｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａａｎｄｔｈｅＡｅｒｏｍｏｎａｓｂａｃｔｅｒｉａｓｔｒａｉｎｓｗｈｉｃｈｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｗａｔｅｒｏｒｄｉｓｅａｓｅｄｆｉｓｈ，ｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃａｎｄｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｃｈｌｏｒｉｎｅｄｉｏｘｉｄｅｔｏＡｅｒｏｍｏｎａｓｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｙｄｏｕｂｌｅｂｒｏｔｈｄｉｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｈｌｏｒｉｎｅｄｉｏｘｉｄｅｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｂａｃｔｅｒｉｕｍａｔｔｈｅｌｏｗｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ａｎｄｋｉｌｌｅｄｔｈｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｔｔｈｅｈｉｇｈｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｍｉｎｉｍａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ）ｏｆｃｈｌｏｒｉｎｅｄｉｏｘｉｄｅｔｏｓｅｖｅｎＡｅｒｏｍｏｎａｓｂａｃｔｅｒｉｕｍａｒｅ１２ｍｇ／ＬｔｏｓｔｒｉａｎｓＡＴＣＣ７９６６，Ｔ１，Ｔ３，Ｔ４，Ｔ５ａｎｄＴ６，ａｎｄ２４ｍｇ／ＬｔｏｓｔｒａｉｎＴ２； Tｈｅｍｉｎｉｍａｌｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＭＢＣ）ｏｆｃｈｌｏｒｉｎｅｄｉｏｘｉｄｅｔｏＡｅｒｏｍｏｎａｓａｒｅ９６ｍｇ／ＬｔｏｓｔｒｉａｎｓＡＴＣＣ７９６６，Ｔ１，Ｔ３ａｎｄＴ４，ａｎｄ３８４ｍｇ／ＬｔｏｓｔｒａｉｎｓＴ２，Ｔ５ａｎｄＴ６．Ｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｐｒｏｖｉｄｅｄｔｈｅｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｂａｓｉｓｆｏｒｒｅａｓｏｎａｂｌｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｈｌｏｒｉｎｅｄｉｏｘｉｄｅ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃｈｌｏｒｉｎｅｄｉｏｘｉｄｅ；Ａｅｒｏｍｏｎａｓ；ＭＩＣ；ＭＢＣ

气单胞菌属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）广泛分布于自然界，其中嗜水气单胞菌（Ａ. ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、豚鼠气单胞菌（Ａ. ｃａｖｉａｅ）及温和气单胞菌（Ａ. ｓｏｂｒｉａ）等已被确认是多种水产动物重要的病原菌，常给养殖生产带来较大的经济损失［１］。二氧化氯作为水产养殖上常用的消毒剂，不仅能大幅度减少养殖水体中致病微生物的数量，而且不损害浮游生物，对水体具有消毒、增氧作用［２］，对鱼类的出血性败血病、烂鳃病、赤皮病、肠炎、水霉病和对虾的弧菌病、病毒病等均有显著疗效。经农业部新渔药临床试验检测认定，稳定性二氧化氯无刺激性、不损伤水生生物，能改善水质，与其他对照药物相比，具有杀菌时间短、副作用小等优点，可用于水产品育苗［３－１０］。本研究以嗜水气单胞菌标准菌株ＡＴＣＣ７９６６、分离自患病鲫鱼和养殖水环境中的气单胞菌作为试验菌株，研究二氧化氯对气单胞菌的抑菌及杀菌效果，为二氧化氯在水产养殖上的合理使用提供依据。

１材料与方法

１．１材料

二氧化氯制剂（购自四川华强渔牧药业有限公司，规格１００ｇ／袋，含８．０ｇ亚氯酸钠）；培养基为牛肉膏液体和固体培养基，ｐＨ（７．０±０．２），中和剂（５ｇ／Ｌ硫代硫酸钠和５ｇ／Ｌ吐温－８０）；试验所用其他试剂均为分析纯。

供试菌株嗜水气单胞菌标准菌株ＡＴＣＣ７９６６购自中国农业微生物保藏中心；气单胞菌Ｔ１和Ｔ２菌株分离自患病鲫鱼；气单胞菌Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５和Ｔ６菌株均分离自养殖水环境。

１．２方法

１．２．１菌悬液的制备将各供试菌株纯培养物用单倍营养肉汤培养，经增菌摇床过夜培养，取２４ｈ新鲜培养物加甘油置于－８０ ℃冰箱中保存备用，试验前1 d取出接种于营养琼脂斜面，２８ ℃恒温培养２４ｈ后取出，用胰蛋白胨生理盐水溶液（ＴＰＳ）洗下菌苔，制成菌悬液，分别取各菌悬液与有机干扰物（３％牛血清白蛋白）以１∶１的体积比混合制备成试验菌悬液，备用。

１．２．２二氧化氯对气单胞菌最小抑菌浓度（ＭＩＣ）的测定用蒸馏水将二氧化氯制剂稀释成８个浓度梯度的受试液，折合二氧化氯含量分别为３、６、１２、２４、４８、９６、１９２、３８４ｍｇ／Ｌ；依次取各稀释度受试液２．５ｍＬ加入到含２．５ｍＬ双倍浓度营养肉汤的试管中，然后接种０．１ｍＬ含菌量约为１０８ＣＦＵ／ｍＬ的菌悬液，作为试验组。以同样方法接种各供试菌株菌悬液于不含二氧化氯制剂的营养肉汤中，作为阳性对照组。阴性对照组只含营养肉汤，不接种细菌。２８ ℃恒温培养２４ｈ，观察结果。通过观察细菌的生长情况，确定二氧化氯对气单胞菌的ＭＩＣ。

当阳性对照组有细菌生长（浑浊），阴性对照组无菌生长（透明），试验组中无菌生长的最低二氧化氯浓度即为二氧化氯对该供试菌株的ＭＩＣ。

１．２．３二氧化氯对气单胞菌最小杀菌浓度（ＭＢＣ）的测定在ＭＩＣ测定试验的基础上进行ＭＢＣ的测定，ＭＩＣ测定试验培养２４ｈ后，观察结果，分别吸取试验组中无菌生长的抗（抑）菌剂０．５ｍＬ于含４．５ｍＬ中和剂溶液的试管中，混匀，作用10 ｍｉｎ；吸取中和后的样液２．５ｍＬ加入到含２．５ｍＬ双倍浓度营养肉汤的试管中。同时设阳性对照组、阴性对照组、中和剂对照组。２８ ℃恒温培养２４ｈ，观察结果。

当阳性对照组有细菌生长（浑浊），阴性对照组无菌生长（透明），中和剂对照组无菌生长（透明），试验组中无菌生长的最低二氧化氯浓度即二氧化氯对该供试菌株的ＭＢＣ。

２结果与分析

２．１二氧化氯对气单胞菌的抑菌作用

各菌株在含有不同浓度的二氧化氯的营养肉汤中培养２４ｈ后观察二氧化氯对各气单胞菌菌株的抑菌作用，结果见表１。由表１可知，阳性对照组试管均浑浊，表示７种供试菌株在２４ｈ内均能存活或增殖，阴性对照组各试管均透明，表示培养液无菌。试验组各试管在不同浓度下表现为透明或浑浊现象，其中二氧化氯浓度在６ｍｇ／Ｌ及以下浓度时，试验组各试管（Ｔ２菌株除外）均表现为浑浊现象，表示二氧化氯在该浓度下不能抑制细菌的生长，而二氧化氯浓度在１２ｍｇ／Ｌ及以上浓度时，各试管（Ｔ２菌株除外）均表现为透明现象，表示在该浓度下细菌的生长被抑制；Ｔ２菌株组在二氧化氯浓度为１２ｍｇ／Ｌ及以下浓度时表现为浑浊现象，在２４ｍｇ／Ｌ及以上浓度时，二氧化氯能抑制Ｔ２菌株的生长。

２．２二氧化氯对气单胞菌的杀菌作用

在二氧化氯抑菌试验的基础上，加入中和剂中和二氧化氯制剂的残留作用，在营养肉汤中继续培养２４ｈ后观察二氧化氯对各气单胞菌菌株的杀菌作用，结果见表２。由表２可知，阳性对照组各试管均浑浊，表明７种供试菌株在２４ｈ内均能存活或增殖；阴性对照组各试管均透明，表明培养液无菌生长；中和剂对照组各试管均透明，表明中和剂无菌。试验组各试管在不同浓度下表现为透明或浑浊现象，其中ＡＴＣＣ７９６６、Ｔ１、Ｔ３、Ｔ４菌株在二氧化氯浓度为４８ｍｇ／Ｌ及以下浓度时，而Ｔ２、Ｔ５、Ｔ６菌株则在二氧化氯浓度为１９２ｍｇ／Ｌ及以下浓度时，试验组各试管表现出浑浊现象，表明该浓度下的二氧化氯只是抑制了细菌的生长，不能杀灭细菌，在二氧化氯的残留作用被中和剂中和后，细菌重新开始生长增殖；而ＡＴＣＣ７９６６、Ｔ１、Ｔ３、Ｔ４菌株在二氧化氯浓度为９６ｍｇ／Ｌ及以上浓度时，Ｔ２、Ｔ５、Ｔ６菌株则在二氧化氯浓度为３８４ｍｇ／Ｌ及以上浓度时，试验组各试管均表现为透明现象，即在二氧化氯的残留作用被中和剂中和后，培养液中无细菌生长繁殖，表明在该浓度下细菌已被杀灭。

２．３二氧化氯对气单胞菌的ＭＩＣ和ＭＢＣ

根据二氧化氯对气单胞菌的ＭＩＣ及ＭＢＣ的评判方法，抑菌试验中无菌生长的最低二氧化氯浓度即为二氧化氯对该供试菌株的ＭＩＣ，杀菌试验中无菌生长的最低二氧化氯浓度即为二氧化氯对该供试菌株的ＭＢＣ。二氧化氯对７种供试菌株的ＭＩＣ和ＭＢＣ见表３。在本试验所设定的浓度梯度下，二氧化氯对各气单胞菌菌株的ＭＩＣ为１２ｍｇ／Ｌ（对Ｔ２菌株的ＭＩＣ为２４ｍｇ／Ｌ）；而二氧化氯对各气单胞菌菌株的ＭＢＣ有所不同，其中对ＡＴＣＣ７９６６、Ｔ１、Ｔ３、Ｔ４菌株的ＭＢＣ为９６ｍｇ／Ｌ，但对Ｔ２、Ｔ５、Ｔ６菌株的ＭＢＣ为３８４ｍｇ／Ｌ。

３讨论

气单胞菌广泛存在于养殖水环境中，是重要的水生动物病原菌之一。二氧化氯是水产养殖上常用的消毒剂之一，目前应用于池塘水体消毒的二氧化氯有一元二氧化氯和二元二氧化氯两种。二元二氧化氯对水生动物致病菌的抑菌及杀菌效果的研究已展开，江为民等［３］测定了二氧化氯对１０种甲鱼致病菌在营养肉汤中的ＭＩＣ和在池塘水体中的ＭＢＣ，结果表明，二氧化氯在营养肉汤中对病原菌有一定的抑菌作用，对其中６种致病菌的ＭＩＣ小于２５ μｇ／ｍＬ；二氧化氯对池塘水体的杀菌效果较理想，对其中７种致病菌的ＭＢＣ小于６．２５ μｇ／ｍＬ，以作用３０ｍｉｎ杀菌效果最佳，认为二氧化氯在甲鱼病害防治上是一种较有前途的药物。艾晓辉等［４］在１３～１５ ℃条件下，测定了二氧化氯制剂（亚氯酸盐与酸性活化剂质量比１∶１）对嗜水气单胞菌９１２０和Ｔ３菌株、鱼害粘球菌（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓｐｉｓｃｉｃｏｌａ）Ｇ４菌株、肠型点状产气单胞菌（Ａ．ｐｕｎｃｔａｔａｆ．ｉｎｔｅｒｔｉｎａｌｉs）５８－２０－９菌株、荧光极毛杆菌（Ｐseudomonas ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）５６－１２－１０菌株、点状产气单胞菌点状亚种（Ａ．ｐｕｎｃｔａｔａｓｕｂ．ｐｕｎｃｔａｔａ）ＳＴ７８－３－３菌株、鳗弧菌（Ｖｉｂｒｉｏａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）Ｅ３－１１菌株等７种水产养殖动物致病菌作用３０ｍｉｎ的ＭＢＣ分别为３．１２、３．１２、１．５６、１２．５０、２５．００、６．２５、１２．５０ μｇ／ｍＬ。陈超然等［５］测定了二氧化氯对柱状嗜纤维菌（Ｃｙｔｏｐｈａｇａｃｏｌｕｍｎａｒｉｓ）ＧＣＲ－９０６１菌株和ＳＣ－２菌株的ＭＢＣ分别为１．５６ｍｇ／Ｌ和０．７８ｍｇ／Ｌ；对嗜水气单胞菌ＢＳ－６菌株和ＺＨＢ－７菌株的ＭＢＣ分别为１．５６ｍｇ／Ｌ和０．７８ｍｇ／Ｌ；对鳗弧菌（Ｖｉｂｒｉｏａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ）Ｊ－Ｏ－１菌株和Ｋ－３菌株的ＭＢＣ分别为３．１３ｍｇ／Ｌ和１．５６ｍｇ／Ｌ；对迟钝爱德华氏菌（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａｔａｒｄａ，Ｅｔ）ＥＦ－１菌株和ＥＴ－１２菌株的ＭＢＣ均为１．５６ｍｇ／Ｌ。刘小燕等［６］测定了二氧化氯对肠型点状气单胞菌、嗜水气单胞菌、柱状曲桡杆菌（Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒｃｏｌｕｍｎａｒｉｓ）的ＭＩＣ分别为０．１７、０．１７、０．０６ μｇ／ｍＬ，ＭＢＣ分别为０．２３、０．２３、０．１７ μｇ／ｍＬ。而本试验所用二氧化氯为一元二氧化氯，其规格为１００ｇ二氧化氯制剂中含有效成分亚氯酸钠８.0 ｇ，在试验设定的浓度梯度下，二氧化氯对各气单胞菌菌株的ＭＩＣ为１２ｍｇ／Ｌ（对Ｔ２菌株的ＭＩＣ为２４ｍｇ／Ｌ），而二氧化氯对各气单胞菌菌株的ＭＢＣ有所不同，其中对ＡＴＣＣ７９６６、Ｔ１、Ｔ３、Ｔ４菌株的ＭＢＣ为９６ｍｇ／Ｌ，但对Ｔ２、Ｔ５、Ｔ６菌株的ＭＢＣ为３８４ｍｇ／Ｌ；但是，由于试验观察到从浑浊变为透明的浓度范围较大，如Ｔ２、Ｔ５、Ｔ６菌株MBC的范围为１９２～３８４ｍｇ／Ｌ，所以二氧化氯对７种供试菌株的ＭＩＣ或ＭＢＣ实际值可能要低于本试验确定的数值。一元二氧化氯配制方法简单，使用相对比较安全，但受含量的限制（不得高于１０％），其施用效果往往不尽如人意。二元二氧化氯含量高，为Ａ、Ｂ两种分装，Ａ主要成分为亚氯酸钠和稳定剂碳酸钠，Ｂ的主要成分为活化剂柠檬酸等。

本试验分别采用嗜水气单胞菌的标准菌株ATCC7966、分离自患病鲫鱼以及养殖水环境中的气单胞菌为试验菌株，研究二氧化氯作为水产养殖上常用消毒剂的抑菌及杀菌效果，这一结果可为二氧化氯的合理使用提供一定的依据。

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