流式细胞术检测骨肉瘤中RUNX3和β—catenin的表达及意义

吴同申　彭圣智　孟彦

[摘要] 目的 检测骨肉瘤中RUNX3和β-catenin的表达，探讨其关系及临床意义，以期为临床工作提供理论支持。 方法 应用流式细胞术检测86例骨肉瘤（观察组）及40例良性骨肿瘤（对照组）中RUNX3和β-catenin的表达，观察其在不同临床特征中的意义，观察RUNX3和β-catenin的关系。 结果 RUNX3和β-catenin在骨肉瘤中的表达量明显低于对照组，骨肉瘤中RUNX3和β-catenin的表达量在不同软组织浸润及不同Ennecking分期的比较中，有明显差别。线性相关分析显示骨肉瘤中RUNX3和β-catenin具有正相关。 结论 RUNX3和β-catenin在骨肉瘤中表达异常，两者可能存在协同作用，检测两种术后的表达对判断预后有一定价值。

[关键词] 骨肉瘤；RUNX3；β-catenin；流式细胞术

[中图分类号] R738.1[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701（2012）32-0004-02

骨肉瘤临床多见，其在发展过程中可见机体多种蛋白质异常表达[1]。RUNX3是一种抑癌基因，定位于染色体1p36.1，基因序列高度保守，对细胞的生长发育过程发挥重要作用[2]。β-catenin是黏附家族的一个经典成员，是上皮细胞表面的重要黏附分子[3]。本实验应用流式细胞术检测骨肉瘤中RUNX3和β-catenin的表达，关注其临床价值，旨在为临床工作提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 临床资料

收集我院、山东大学齐鲁医院、山东大学第二医院经病理证实的骨肉瘤86例新鲜标本作为观察组。纳入均经病理学确诊，并符合WHO关于软组织与骨肿瘤病理学和遗传学的诊断标准。年龄为18～59岁，平均39.08岁，其中男50例，女36例。患者手术前均未进行任何放化疗。对照组为同期在我院治疗的良性骨肿瘤术后脱钙的标本40例，骨样骨瘤20例，骨母细胞瘤20例，年龄18～56岁，平均38.9岁。两组在一般临床特征的比较中，无明显差别，具有可比性。

1.2 流式细胞术检测方法

RUNX3和β-catenin试剂均购自武汉博士德生物技术有限公司。RUNX3和β-catenin的检测应用流式细胞术。具体步骤：将脱钙后的标本置于不锈钢网上，将组织剪成碎屑，然后用镊子轻搓，生理盐水同时冲洗，直到组织搓完。收集混悬液，过滤，离心，制成1×106/mL单细胞悬液，加入抗体后孵育30 min，然后洗涤，撇弃上清液，加入二抗工作液FITC-IgG 100 μL，孵育30 min，加入PBS 10 mL，离心，撇弃上清。加入PBS，过滤后上机进行检测[4]。流式细胞仪（美国BC公司生产），免疫荧光数据分析应用系统自带软件进行。

1.3 结果判定标准

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，计数资料用均数±标准差表示，采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RUNX3和β-catenin在观察组与对照组中的表达

RUNX3和β-catenin在观察组与对照组中的表达量均存在明显差异，P < 0.05。见表1。

2.2 观察组中不同临床特征患者RUNX3和β-catenin的表达差异

观察组中RUNX3和β-catenin的表达与骨肉瘤的软组织浸润及Ennecking分期相关。见表2。

2.3 观察组中RUNX3和β-catenin表达的关系

经线性相关分析，骨肉瘤中RUNX3和β-catenin的表达呈正相关（r = 0.45，P = 0.034 2 < 0.05）。

2.4 观察组中RUNX3和β-catenin的表达与预后的关系

观察组患者随访时间为8～48个月，平均28.2个月，观察组中RUNX3和β-catenin的表达与预后相关（P < 0.05），即RUNX3和β-catenin低表达的患者预后差。

3 讨论

骨肉瘤是临床常见，细胞连接和细胞外基质多存在异常。控制RUNX3基因转录的是P1和P2启动子，这两个启动子结构不同。P2在外显子2之前，周围有一个CpG岛，富含GC启动子的特征，是一个高度保守区。RUNX3与肿瘤的发展有密切关系，是一个抑癌基因，抑癌的机制尚不十分清楚[5]。RUNX3对消化道上皮细胞的生长具有重要的调控作用，能抵抗TGF-β诱导的细胞生长抑制和细胞凋亡，从而调控上皮细胞的分化过程[6]。而当RUNX3 失活时，影响TGF-β凋亡信号的传导，阻滞正常的凋亡过程，正常细胞的增殖不受限制，出现细胞恶变。β-catenin是黏附家族的成员，与其他黏附家族成员一起与E-cadherin结合，介导肿瘤细胞及上皮细胞的黏附，抑制肿瘤的侵袭和转移。既往对β-catenin细胞黏附方面的作用研究较多[7]，但是在正常分化成熟的细胞中，β-catenin通过与膜表面的E-cadherin结合参与同质性黏附。当β-catenin降解障碍时，细胞质内β-catenin水平升高，引起β-catenin大量聚集进入细胞核内与转录因子结合启动下游靶基因的转录[8，9]。

本实验通过流式细胞术检测骨肉瘤中RUNX3和β-catenin的表达特点，结果显示骨肉瘤中RUNX3和β-catenin的表达量明显低于对照组，提示RUNX3和β-catenin表达的丢失在肿瘤进展中起重要作用。实验结果显示，观察组中RUNX3和β-catenin的表达量均与有、无软组织浸润及Ennecking的分期有关，由于骨肉瘤中软组织浸润及Ennecking分期均与患者的预后密切相关，因此术后对骨肉瘤患者行RUNX3和β-catenin的流式细胞术检测，可能对判断患者预后有一定价值，即RUNX3和β-catenin低表达患者的预后差，本实验生存分析也直接证实了二者在肿瘤中预后的判断价值。侵袭和转移是恶性肿瘤生物学行为的重要标志，是导致死亡和影响预后的主要原因之一。实验结果显示骨肉瘤中RUNX3和β-catenin的表达呈正相关，提示RUNX3和β-catenin可能有正向协同效应，即RUNX3和β-catenin可能具有通路作用，即RUNX3和β-catenin协同作用时，参与肿瘤细胞外细胞连接的改变，共同促进肿瘤的生长、侵袭和转移，但是具体的详细调节机制尚不清楚，有待更多基础实验验证。

总之，流式细胞术检测RUNX3和β-catenin在骨肉瘤中低表达，二者可能具有协同作用，术后应用流式细胞术检测RUNX3和β-catenin的表达可能对判断预后有一定价值。

[参考文献]

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（收稿日期：2011-11-22）