猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的血清型鉴定与药敏试验

蔡丙严等

摘要：从江苏泰州地区疑似猪传染性胸膜肺炎发病猪采集病料，经细菌分离培养得到了３株分离株ＴＺＡ１、ＴＺＡ２和ＴＺＡ３株。经形态学检查、ＣＡＭＰ试验、生化试验和血清型鉴定，确定ＴＺＡ１株和ＴＺＡ２株为血清１型，ＴＺＡ３株为血清３型。药敏试验显示，３株分离菌株对恩诺沙星、阿齐霉素、头孢唑肟高度敏感。

关键词：猪胸膜肺炎放线杆菌；血清型鉴定；药敏试验

中图分类号：Ｓ８５８．２８文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）04－0780-03

胸膜肺炎放线杆菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＡＰＰ）是革兰氏阴性、有荚膜的多形球杆菌，有时呈线性，无鞭毛，不运动，不形成芽孢。根据培养时是否需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＮＡＤ，又称Ｖ因子），可将ＡＰＰ分为生物Ⅰ型和生物Ⅱ型，生物Ⅰ型为ＮＡＤ依赖株，包括血清型１～１２ 型和１５ 型，生物Ⅱ型的生长不依赖ＮＡＤ，但需要其他特定嘌呤或嘌呤前产物以辅助生长，含有２个血清型，为血清型１３和１４［１］。猪感染ＡＰＰ后的疾病是猪传染性胸膜肺炎（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｉａ，ＰＣＰ），急性暴发时有很高的发病率和死亡率。一些病猪康复后常伴有慢性肺炎，导致生长停滞且长期带菌而成为其他猪的传染源，此病给养猪业造成较大的经济损失［２］。本研究从江苏泰州地区部分规模猪场临床表现为胸膜肺炎的病料中进行病原分离和血清型鉴定，并对分离菌株进行药敏试验，以期为泰州地区猪传染性胸膜肺炎的防控、净化提供理论支撑。

１材料和方法

１．１材料

ＰＰＬＯ琼脂和ＮＡＤ购于扬州市广陵区全球通实验用品销售中心；犊牛血清购于杭州四季青生物工程有限公司；常规培养基、生化试剂和药敏纸片（氟苯尼考和强力霉素为自制）购于杭州天和微生物试剂有限公司；ＡＰＰ １、３、５、７、９型阳性血清购于中国农业科学院兰州兽医研究所；金黄色葡萄球菌为本实验室保存；待检病料采集于泰州市规模猪场的疑似猪传染性胸膜肺炎的病猪。

１．２试验方法

１．２．１细菌的分离培养与形态观察取死亡猪的气管分泌物和肺脏作涂片，革兰氏染色，镜检；同时取病料接种于含２％ ＮＡＤ的ＰＰＬＯ琼脂平板，在５％～１０％ ＣＯ２条件下，３７ ℃培养２４ ｈ。然后挑取可疑菌落涂片，镜检。纯培养后，以４０％甘油生理盐水或２０％脱脂牛奶于－７０ ℃保存备用［３］。

１．２．２CＡＭＰ试验用金黄色葡萄球菌在兔血琼脂平板上划一直线，再用分离菌划线与该线垂直但不相接触的２条直线，３７ ℃培养２４～３６ ｈ，观察试验结果。

１．２．3生化试验将分离菌株分别接种含有０．０２％ ＮＡＤ的乳糖、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露醇、山梨醇、靛基质、甲基红、Ｖ－Ｐ试验、硝酸盐、卫星现象和尿素酶等微量生化试管，３７ ℃培养２４～４８ ｈ，观察和记录试验结果。

１．２．4药敏试验检测分离菌株对氟苯尼考、强力霉素、复方新诺明、丁胺卡那霉素、恩诺沙星、氨苄西林、头孢唑肟和阿奇霉素８种抗生素的敏感性。将保存好的菌液（浓度稀释到１．５×１０８个／ｍＬ） 均匀涂布在ＰＰＬＯ琼脂上， 然后将药敏纸片贴在平皿上，培养２４ ｈ后观察结果，并按抗菌药物药敏试验判定标准判定分离菌株对不同抗生素的敏感程度［４］。

１．２．5菌株血清型鉴定将纯化培养的分离菌株３７ ℃培养２４ ｈ，用生理盐水洗下，制成生理盐水细菌悬液。取１滴ＡＰＰ可疑菌株分别与ＡＰＰ １、３、５、７、９单因子标准阳性血清均匀混合，按照常规方法进行平板凝集试验，观察结果。

２结果

２．１细菌的形态特征

病料涂片以及分离纯化菌革兰氏染色、镜检，都可见有革兰氏阴性、多形态的细菌，多为球杆菌、短杆菌、偶有成丝状的细菌，着色不均。

２．２分离菌的培养特性

３株分离菌在加入2% ＮＡＤ的ＰＰＬＯ固体培养基上培养２４ ｈ，可见１～２ ｍｍ、露珠狀、半透明的菌落。

２．３CＡＭＰ试验

３株分离菌在靠近金黄色葡萄球菌的地方出现明显的溶血区域，即CＡＭＰ试验阳性。

２．4生化试验

３株分离菌均呈卫星现象，可水解尿素酶，发酵乳糖、果糖、葡糖糖，不发酵甘露醇、山梨醇、鼠李糖及阿拉伯糖。靛基质、甲基红、Ｖ－Ｐ试验均为阴性。硝酸盐还原试验阳性，生长需要ＮＡＤ。

２．5血清型鉴定

ＴＺＡ１株、ＴＺＡ２株与ＡＰＰ １型阳性血清发生强烈的凝集发应，鉴定为血清１型；ＴＺＡ３株与ＡＰＰ ３型阳性血清发生强烈的凝集发应，鉴定为血清３型。３株菌株与生理盐水和其他血清型的阳性血清未见凝集现象，结果见表１。

２．6药敏试验

ＴＺＡ１和ＴＺＡ２株对恩诺沙星和阿奇霉素极度敏感。ＴＺＡ３对头孢唑肟极度敏感。３株分离菌对氟苯尼考、丁胺卡那霉素、强力霉素中度敏感，对复方新诺明和氨苄西林低敏，结果见表２。

３小结与讨论

３．１ＡＰＰ分离

胸膜肺炎放线杆菌营养要求高且受外界影响因素较多，初次比较困难。在分离的过程中，对于病死猪最好在刚死亡或频临死亡时采集病料，否则，即使病料中有ＡＰＰ感染，也会因猪死亡时间长，致使病料中ＡＰＰ死亡［５］。应在初次分离培养的培养基中加入ＮＡＤ，否则APP在常规培养基中大多不生长或生长不良。本次分离选择加入ＮＡＤ的ＰＰＬＯ琼脂培养基，成功分离到了３株ＡＰＰ菌株。

３．２ＡＰＰ血清型鉴定

胸膜肺炎放线杆菌在不同国家和地区流行菌株的血清型有所不同［６］。研究表明，我国流行的猪传染性胸膜放线杆菌血清型以１型、３型、７型为主［７］。因此，本试验选用胸膜肺炎放线杆菌标准单因子阳性血清１、３、５、７、９型为鉴定标准，结果从泰州地区规模猪场分离到的３株ＡＰＰ菌株，血清分型试验鉴定ＴＺＡ１和ＴＺＡ２为血清１型，ＴＺＡ３为血清３型。本次试验基本摸清了泰州地区ＡＰＰ流行菌株的优势血清型，为本地区猪场猪传染性胸膜肺炎的免疫预防奠定了基础。

３．3ＡＰＰ药敏试验

药敏试验结果表明，３株分离菌对同种药物的敏感性有较大差异，其中ＴＺＡ１和ＴＺＡ２两个分离株对恩诺沙星和阿奇霉素极度敏感，而ＴＺＡ３株对头孢唑肟极度敏感。本药敏试验筛选出的恩诺沙星、阿奇霉素、头孢唑肟和氟苯尼考可作为治疗本地区PCP的首选药物。研究表明，多种抗菌药物对该菌的治疗效果不理想［４］。兽医临床上常选用的氟苯尼考和强力霉素等药物敏感性不高，究其原因可能是这些抗生素的大剂量、不规范使用导致临床上耐药性的产生。建议规模化猪场在防治PCP时最好通过药敏试验选用敏感度较高的抗生素，以最少的投入获得较大的经济效益。

参考文献：

［１］ 唐文山，李昕．猪传染性胸膜肺炎研究进展［Ｊ］． 动物医学进展，２００８，２９（２）：９８－１０２．

［２］ 徐公义，王海丽， 葛长城， 等． 猪传染性胸膜肺炎的诊断与治疗［Ｊ］．中国畜牧兽医，２００８，３５（５）：１０６－１０７．

［３］ 马晓平，彭广能，曹三杰，等．猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的初步分离鉴定与诊治体会［Ｊ］．中国兽医杂志，２００８，４４（２）：７５－７６．

［４］ 何启盖，王贵平，刘军发，等．猪胸膜肺炎放线杆菌分离鉴定及药敏试验［Ｊ］．中国预防兽医学报，２００３，２５（５）：３６０－３６３．

［５］ 雷连成，华芳，王丽哲，等．猪胸膜肺炎放线杆菌分离鉴定与毒力测定［Ｊ］．中国兽医学报，２００８，２８（４）：3５９－３６２．

［６］ 冼琼珍，黄耿森，叶润全，等．血清６型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离与鉴定［Ｊ］．黑龙江畜牧兽医，２００７（５）：７０－７２．

［７］ 逯忠新，柳纪省，赵萍，等． 猪传染性胸膜肺炎血清抗体检测［Ｊ］．中国兽医科技，２００１，３１（３）：１６－１７．

［８］ 余光勇，郭万柱，徐志文，等．一株四川株猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定［Ｊ］．黑龙江畜牧兽医，２００８（6）：６２－６４．