蜂胶对炭疽杆菌弱毒株的抑菌效果

孙斐,许兵红,杨小林,张佑宏,李进芬

摘要：为了解产自河南省的蜂胶对炭疽杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）弱毒株的抑菌作用，采用琼脂平板扩散法将实验分为ｐＨ ５．５～８．５不同组（蜂胶浓度３１％），以及在ｐＨ ５．５下将３１％蜂胶溶液倍比稀释至０．０６％（１∶５１２）及空白组（０％），在每张滤纸片上滴加蜂胶溶液７ μＬ，记录蜂胶的抑菌效果。结果表明，河南省蜂胶在ｐＨ ５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５平板上的抑菌环直径依次为（１９．１６±０．２９）、（１７．６７±０．２９）、（１４．６７±０．５８）、（１３．６７±０．２９）、（１４．００±０．００）、（１３．３３±１．１５）、（１２．００±０．００） ｍｍ，蜂胶浓度分别为１５．５0％、７．７５％、３．８８％、１．９４％、０．９７％、０．４８％、０．２４％、０．１２％、０．０６％和０％（空白组）的抑菌环直径依次为（１９．５０±１．８０）、（１９．６７±１．０４）、（１７．７５±０．３５）、（１５．６７±０．５８）、（１４．００±２．２９）、（１３．１７±１．０４）、（１１．８３±１．５３）、（１０．８３±１．２６）、（９．００±０．００）和（０．００±０．００） ｍｍ。说明河南蜂胶对炭疽杆菌弱毒株有明显的抑菌活性，对炭疽杆菌的抑菌活性随ｐＨ值增加或浓度降低而减小。

关键词：蜂胶；炭疽杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）；抑菌效果

中图分类号：Ｒ３７８．７文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）05－0926-02

The Antibacterial Activity of Propolis against an Attenuated Strain of Bacillus anthracis

ＳＵＮ Ｆｅｉ１，ＸＵ Ｂｉｎｇ－ｈｏｎｇ１，ＹＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｌｉｎ２，ＺＨＡＮＧ Ｙｏｕ－ｈｏｎｇ２，ＬＩ Ｊｉｎ－ｆｅｎ１

（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３， Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｏｉｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｐｏｌｉｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｅｎａｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ａｎ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ， ｔｈｅ ａｇａｒ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｔｅｓｔ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｐｌａｔｅｓ ｓｍｅａｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｗｅｒｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐＨ （５．５， ６．０， ６．５， ７．０， ７．５， ８．０ ａｎｄ ８．５） ｏｆ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｔｅｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｏｐｏｌｉｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｅｓｔ， ７ μＬ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｅａｃｈ ｔｅｓｔｉｎｇ ｐｌａｔｅ， ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｉｎｇ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ａｎｄ ｒｅｃｏｒｄｅｄ ｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ ａｆｔｅｒ ２４ ｈ． Ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ａｆｔｅｒ ２４ ｈ， ｔｈｅ ｄｉａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｐｏｌｉｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｉｎ ｅａｃｈ ｐＨ ｇｒｏｕｐ， ５．５， ６．０， ６．５， ７．０， ７．５， ８．０ ａｎｄ ８．５ ｗｅｒｅ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｒｅｃｏｒｄｅｄ ａｓ （１９．１６±０．２９），（１７．６７±０．２９），（１４．６７±０．５８），（１３．６７±０．２９），（１４．００±０．００），（１３．３３±１．１５），（１２．００±０．００） ｍｍ． Ｔｈｅ ｄｉａｍｅｔｅｒｓ ｉｎ ｅａｃｈ propolis ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ， １５．５０％，７．７５％，３．８８％，１．９４％，０．９７％，０．４８％，０．２４％，０．１２％，０．０６％ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ （１９．５０±１．８０），（１９．６７±１．０４），（１７．７５±０．３５），（１５．６７±０．５８），（１４．００±２．２９），（１３．１７±１．０４），（１１．８３±１．５３），（１０．８３±１．２６），（９．００±０．００），（０．００±０．００）ｍｍ ｏｒｄｅｒｌｙ． Ｉｔ was ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｐｒｏｐｏｌｉｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｅｎａｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅ had ｏｂｖｉｏｕｓ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｄｕｃｅｄ ａｌｏｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｐＨ ｏｒ ｔｈｅ ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｒｏｐｏｌｉｓ； Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ； ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ

蜂胶是蜜蜂从植物芽苞或树干上采集的树胶混入蜜蜂上颚腺分泌物和蜂蜡后加工制成的树脂状固态物质，含有大量的生物活性物质和微量元素，具有广泛的药理作用。Ｋｕｊｕｍｇｉｅｖ等［１］研究报道，不同产地的蜂胶虽然在化学组成上有所不同，但抗菌作用基本相同，显示蜂胶抗菌活性为混合物整体效果。Ｈｅｇａｚｉ等［２］对产自奥地利、德国和法国三地的蜂胶对比研究发现，三地蜂胶化学组成中各成分比例不同，抗菌活性也不尽相同。近几年，关于蜂胶研究的文献日渐增多。我国对蜂胶抗菌作用的公开报道十分零碎，尚无系统性研究报道，关于河南省蜂胶的抗菌活性，乔智胜等［３］曾报道从蜂胶中分离到３种对金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）具有抗菌活性的成分，以后再无相关公开报道。我们课题组首次就河南省蜂胶对医学原虫的抗生作用［４］、对常见医学真菌的抗菌作用［５］和对常见医学细菌的抗菌作用［６］进行了系统的研究，现将河南省蜂胶对炭疽杆菌弱毒株的抑菌作用报道如下。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１蜂胶溶液配制将产自河南省的蜂胶溶于９５％乙醇，２周后过滤，得蜂胶乙醇溶液，计算得蜂胶浓度为３１％。

１．１．２应试菌种炭疽杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）弱毒株购自北京生物制品研究所，由本实验室传代保种，使用前接种到ｐＨ ６．５固体培养基上，３７ ℃恒温培养１６～１８ ｈ备用。

１．２方法

１．２．１抑菌活力测定采用平板滤纸片法，滤纸片直径６．０ ｍｍ，灭菌干燥后备用。固体培养基采用肉汤培养基，配比如下：牛肉５００ ｇ（浸液）、蛋白胨１０ ｇ、ＮａＣｌ ５ ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ １ ｇ、琼脂２０ ｇ，加双蒸水至１ ０００ ｍＬ，调ｐＨ至６．５，每个直径７．５ ｃｍ培养皿加入１２ ｍＬ培养基，制成平板备用。细菌复苏培养后，取培养至对数期细菌配成６×１０８ ＣＦＵ／ｍＬ菌液，取０．１ ｍＬ涂于平板上，将滤纸片加７ μＬ蜂胶溶液样品，３７ ℃培养２４ ｈ后测量记录抑菌环直径。

１．２．２不同ｐＨ蜂胶抑菌实验设置ｐＨ ５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５共８个不同的ｐＨ值平板实验组，每组３次重复，记录３１％蜂胶在不同ｐＨ值平板上的抑菌效果。

１．２．３不同浓度蜂胶抑菌实验培养基ｐＨ ５．５时，设置不同浓度蜂胶实验组和空白对照组，蜂胶原液（３１％）倍比稀释至１∶５１２，９５％乙醇（蜂胶浓度为０％）作对照组，即设置１个空白对照组和９个蜂胶浓度组（浓度为１５．５０％、７．７５％、３．８８％、１．９４％、０．９７％、０．４８％、０．２４％、０．１２％和０．０６％）。每组３次重复，分别记录各组的抑菌效果。

１．２．４统计方法所得数据计算ｘ±ｓ，采用ｔ检验对结果进行统计学分析。

２结果与分析

２．１不同ｐＨ下蜂胶对炭疽杆菌的抑菌效果

ｐＨ ５．０时，不适宜炭疽杆菌生长，未观察到抑菌现象。其余各组均有抑菌现象，ｐＨ ５．５时河南省蜂胶对炭疽杆菌抑菌环直径最大，随ｐＨ增加，抑菌环直径变小（表１）。

２．２不同浓度蜂胶对炭疽杆菌的抑菌效果

随蜂胶浓度降低，对炭疽杆菌的抑菌环直径变小，蜂胶原液稀释至０．０６％时，仍有抑菌环，但环较小。空白对照组未观察到明显的抑菌环（表２）。

３讨论

蜂胶有着悠久的药用历史，其成分复杂，大约由５５％树脂及树香、３０％蜂蜡、１０％芳香挥发油、５％花粉及杂物组成。目前已从蜂胶中分离鉴定的成分有黄酮类、萜烯类、醌类、酯类、醛类、酚类、醚类、有机酸等，还有氨基酸、酶类、维生素类及多糖等物质。蜂胶的化学成分取决于蜜蜂采集树脂的植物和地区，因而不同产地的蜂胶化学组成不同，生物学活性也有差异。温带型蜂胶以欧洲蜂胶为代表，主要成分为黄酮类，如白杨素（Ｃｈｒｙｓｉｎ）、高良姜素（Ｇａｌａｎｇｉｎｅ）、松属素（Ｐｉｎｏｃｅｍｂｒｉｎ）、槲皮素（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、柚皮素（Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）、咖啡酸（Ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ）、阿魏酸（Ｆｅｒｕｌａｉｃ ａｃｉｄ）等。热带型蜂胶以巴西蜂胶为代表，主要成分为萜烯类、芳香酸及其酯类、脂肪酸等［７］。蜂胶中独特的黄酮类、萜烯类物质对多种细菌、真菌、病毒和寄生虫等具有抑制和杀灭作用。

本实验结果表明，ｐＨ ５．５时河南产蜂胶对炭疽杆菌弱毒株的抑菌环直径最大，随ｐＨ增加，抑菌环直径变小。随浓度降低，河南蜂胶对炭疽杆菌弱毒株的抑菌环直径变小，蜂胶原液稀释至１∶５１２即０．０６％时，仍有抑菌环产生。ｐＨ ５．５和６．０组抑菌环显著大于其余各ｐＨ组（Ｐ＜０．０１）；ｐＨ ８．５时河南省蜂胶对炭疽杆菌抑菌环直径最小，与ｐＨ ５．０～７．５各组差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１）；ｐＨ ６．５～８．０各组间差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结果提示，河南蜂胶对炭疽杆菌弱毒株有明显的抑菌活性，在酸性条件下对炭疽杆菌的抑菌活性较强。这种随ｐＨ增高而抑菌活性减弱的变化规律，与课题组前期报道的河南省蜂胶对其他革兰氏阳性菌如溶壁微球菌（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）、金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、甲型链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ）、乙型链球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、白喉杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）的抑菌结果相一致。而与对真菌白色念珠菌（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）的抑菌作用相反。

参考文献：

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［４］ 许兵红，史明珠． 蜂胶体外抗阴道毛滴虫实验［Ｊ］． 中国寄生虫学与寄生虫病杂志，２００６，２４（６）：４７７－４７８．

［５］ 许兵红，曾莉萍，陈萍． 河南蜂胶对白色念珠菌的抑菌作用研究［Ｊ］．中国病原生物学杂志，２００７，２（４）：２５２－２５３．

［６］ 郑斌，许兵红． 蜂胶抗病原生物作用研究进展［Ｊ］． 中国病原生物学杂志，２０１１，６（７）：５４７－５５２．

［７］ ＤＡＵＧＳＣＨ Ａ，ＭＯＲＡＥＳ Ｃ Ｓ，ＦＯＲＴ Ｐ，ｅｔ ａｌ． Ｂｒａｚｉｌｉａｎ ｒｅｄ ｐｒｏｐｏｌｉｓ－ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｏｔａｎｉｃａｌ ｏｒｉｇｉｎ［Ｊ］． Ｅｖｉｄ Ｂａｓｅｄ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ａｌｔｅｒｎａｔ Ｍｅｄ，２００８，５（４）：４３５－４４１．